穴位注射對(duì)氣滯血瘀證雌性大鼠血清NO及子宮組織VEGF/KDR表達(dá)的影響?

萬(wàn)荷天一，陳 睿，唐也笑，羅小光△

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽(yáng) 550004； 2. 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴陽(yáng) 550004)

《素問(wèn)·調(diào)經(jīng)論篇》指出，五臟之道皆出于經(jīng)隧以行血?dú)庋獨(dú)獠缓桶俨∧俗兓砻鳉庋缓?、氣滯血瘀是百病的根源。由于女性自身的生理特點(diǎn)，氣滯血瘀可以作為對(duì)女性疾病病理變化整體反應(yīng)的概括，也是婦科辨證論治的重要依據(jù)。瘀血阻滯沖任、胞宮，則可導(dǎo)致經(jīng)帶胎產(chǎn)雜諸多疾病，常常包括月經(jīng)病、產(chǎn)后病、不孕癥、更年期綜合征等婦科疾病、損美性疾病如黃褐斑、痤瘡等，及相關(guān)并發(fā)癥如高血壓、糖尿病、心血管疾病、肥胖等疾病。近年來(lái)，女性的發(fā)病年齡從青春期到絕經(jīng)期不等，嚴(yán)重影響女性的身心健康和生活質(zhì)量?；谇捌谡n題對(duì)女性疾病的研究表明[1-2]，丹紅穴位注射、桃紅四物湯都能改善氣滯血瘀證大鼠血液流變學(xué)狀態(tài)，顯示出明顯的活血化瘀作用，但丹紅穴位注射、桃紅四物湯對(duì)氣滯血瘀證雌性大鼠是否具有祛瘀生新的作用，以及其作用機(jī)制是否與調(diào)節(jié)祛瘀相關(guān)的血管活性物質(zhì)血清一氧化氮(NO)和血管新生相關(guān)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(KDR)相關(guān)，筆者尚未見(jiàn)報(bào)道。故本課題組通過(guò)觀察穴位注射對(duì)氣滯血瘀證雌性大鼠血清NO、子宮組織VEGF/KDR mRNA及蛋白的表達(dá)，探究丹紅穴位注射可否促進(jìn)血清NO、子宮組織VEGF/KDR表達(dá)，以達(dá)到“祛瘀生新”的作用，為臨床用于氣滯血瘀證各類女性疾病提供新的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

SPF級(jí)雌性SD大鼠40只，6～8周齡，體質(zhì)量250～270 g，由長(zhǎng)沙市天勤生物動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(湘)2014-0010)。大鼠置于安靜、清潔的環(huán)境中分籠飼養(yǎng)，室溫(23±1)℃、濕度(65±5)%、晝夜12 h交替環(huán)境，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、中藥組、穴位注射組每組各10只。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)貴州醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)研究中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查。

1.2 主要試劑及儀器

鹽酸腎上腺素注射液(天津金耀氨基酸有限公司)；NO試劑盒(南京建成科技有限公司)；VEGF兔多克隆抗體(bs-1313R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；KDR兔多克隆抗體(bs-10412R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；Animal Total RNA lsolation Kit、RT EasyTM II(First-strand cDNA synthesis for Real Time PCR)、Real Time PCR EasyTM(均為 FOREGENE公司生產(chǎn))；丹紅注射液20 ml(山東丹紅制藥有限公司)。桃紅四物湯組成：熟地黃24 g，當(dāng)歸12 g，白芍12 g，川芎6 g，桃仁9 g，紅花6 g(貴州醫(yī)科大學(xué))。

轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)(德國(guó)徠卡-2016)；PIKORed 96型實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR儀(美國(guó)ThermoFisher儀器有限公司)；C2500型低溫離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

1.3 模型制備方法

參照文獻(xiàn)[3]備制模型。除空白組外，其余3組大鼠連續(xù)18 d左下腹注射腎上腺素(adrenaline,Adr)0.09 mg/kg，每日1次 給藥后4 h接受1種不可預(yù)見(jiàn)性刺激：A夾尾(10 min)；B烘箱熱烘(10 min)；C冰水游泳(0～4 ℃，4 min)；D晝夜顛倒；E 束縛(10 min)；F傾斜(45°仰斜鼠籠2 h)。造模周期為18 d，以上刺激每天給予1種，整個(gè)周期中每種刺激分別達(dá)到3次。

1.4 治療方法

造模結(jié)束后24 h開(kāi)始治療?？瞻捉M不做其他任何處理，模型組每日抓捕1次，中藥組根據(jù)臨床人用劑量，按照每公斤體質(zhì)量用藥量的人鼠比例換算，用中藥7.25 g/kg灌胃[4]，每日1次共14次。穴位注射組將大鼠俯臥固定于木板上，根據(jù)華興邦大鼠體穴定位圖[5]提供的定位方法，選雙側(cè)肝俞、膈俞穴進(jìn)行常規(guī)消毒后，注射丹紅注射液0.02 mL/穴，每周2次共4次。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

取材：末次治療24 h后心臟取血10 ml，其中3 ml血采集入枸櫞酸鈉采血管中，5 ml血采集入肝素采血管中，均送至貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室做血液流變學(xué)、凝血4項(xiàng)檢測(cè)；2 ml血樣本靜置后離心，采用化學(xué)法做血清NO濃度測(cè)定。取血后迅速剖腹，摘取子宮用0.9%的氯化鈉溶液沖洗后，置于-80℃低溫冰箱凍存用于q-PCR檢測(cè);稱重后放入福爾馬林液中固定24 h，經(jīng)常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，用于免疫組化法檢測(cè)。

熒光定量PCR法檢測(cè)子宮組織VEGF/KDR mRNA的表達(dá)：Trizol法提取子宮組織總RNA，測(cè)定RNA含量和260/280的比值。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，45個(gè)循環(huán)。每樣品重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以2-△△Ct表示樣本中目的基因相對(duì)表達(dá)含量。其中β-actin、VEGFA和VEGFR2等引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)合成，并以ULTRAPAGE純化，其基因序列如下。

表1 PCR引物序列

免疫組化法檢測(cè)子宮組織VEGF/KDR蛋白的表達(dá)：取固定好的石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，用3%H2O2室溫10 min滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、微波加復(fù)合蛋白酶修復(fù)暴露抗原，滴加正常兔血清封閉液，室溫20 min滴加稀釋的一抗(1∶50)4℃過(guò)夜，滴加生物素化二抗37℃30 min，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染脫水，透明中性樹(shù)脂封片，顯微鏡觀察并計(jì)算每張圖像的平均光密度值，檢測(cè)各組大鼠子宮組織VEGF/KDR的蛋白表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物行為學(xué)變化

與空白組比較，模型組大鼠出現(xiàn)精神萎靡或煩躁不安、易激惹、反應(yīng)遲鈍、舌紫暗、進(jìn)食量少、被毛無(wú)光澤、體質(zhì)量減輕等現(xiàn)象；與模型組比較，中藥組和穴位注射組大鼠相對(duì)活潑好動(dòng)，反應(yīng)靈敏。

2.2 穴位注射對(duì)氣滯血瘀證雌性大鼠血液流變學(xué)的影響

表2示，空白組比較，模型組全血(高、中、低)黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞壓積均顯著升高(P<0.01或P<0.001)；與模型組比較，中藥組和穴位注射組的全血黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞壓積均顯著降低(P<0.001或P<0.05)，2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 穴位注射對(duì)氣滯血瘀證雌性大鼠血液流變學(xué)的影響

2.3 穴位注射對(duì)氣滯血瘀證雌性大鼠凝血4項(xiàng)的影響

表3示，與空白組比較，模型組凝血酶時(shí)間(TT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)明顯縮短，纖維蛋白原(FIB)含量明顯增加(P<0.01或P<0.001)；與模型組比較，中藥組和穴位注射組TT、APTT明顯延長(zhǎng)，F(xiàn)IB含量明顯減少(P<0.05或P<0.01)，2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 穴位注射對(duì)氣滯血瘀證雌性大鼠凝血4項(xiàng)的影響

2.4 穴位注射對(duì)氣滯血瘀證雌性大鼠血清NO濃度的影響

表4示，與空白組比較，模型組NO顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，中藥組和穴位注射組NO含量明顯升高，2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表4 穴位注射對(duì)氣滯血瘀證雌性大鼠血清NO濃度的影響

2.5 穴位注射對(duì)氣滯血瘀證雌性大鼠子宮組織VEGF、KDR蛋白及mRNA表達(dá)的影響

表5圖1示，各組均可見(jiàn)VEGF、KDR蛋白表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞呈黃色或棕黃色，VEGF陽(yáng)性產(chǎn)物主要分布于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)，KDR陽(yáng)性產(chǎn)物主要分布在細(xì)胞質(zhì)。與空白組比較，模型組子宮組織的VEGF、KDR蛋白表達(dá)均降低(P<0.05);與模型組比較,中藥組和穴位注射組子宮組織VEGF、KDR蛋白表達(dá)升高(P<0.05),2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表5示，PCR結(jié)果顯示與空白組比較，模型組VEGF、KDR mRNA均顯著降低(P<0.05);與模型組比較,中藥組和穴位注射組VEGF、KDR mRNA顯著升高(P<0.05),2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表5 穴位注射對(duì)氣滯血瘀證雌性大鼠子宮組織VEGF/KDR蛋白及mRNA表達(dá)的影響

3 討論

本研究復(fù)制氣滯血瘀證大鼠模型發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，模型組全血(高、中、低)黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞壓積均顯著升高，TT、APTT明顯縮短，F(xiàn)IB含量明顯增加，大鼠出現(xiàn)神?；驘┰?、易激惹、淡漠等癥狀，符合適宜于氣滯血瘀證女性疾病特點(diǎn)的雌性大鼠模型[6-7]。

穴位注射療法通過(guò)經(jīng)穴-臟腑體系注射給藥，發(fā)揮針、藥、穴的協(xié)同作用，一定程度上會(huì)放大藥物的藥理作用[8]。本實(shí)驗(yàn)選擇大鼠的雙側(cè)肝俞、膈俞穴，肝俞是肝之背俞穴，具有疏肝解郁、理氣活血的作用；膈俞為八會(huì)穴之血會(huì)，具有養(yǎng)血生血、活血化瘀、理氣和營(yíng)之功效。穴位注射的藥物是丹紅注射液，丹紅注射液是丹參與紅花的復(fù)方提取液。丹參善治血分，祛瘀生新，調(diào)經(jīng)順脈[9]；紅花養(yǎng)血活血、破血通經(jīng)[10]。桃紅四物湯是治療氣滯血瘀證婦科疾病的經(jīng)典名方，其活血化瘀作用已在許多實(shí)驗(yàn)研究中得到證實(shí)[11-13]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組比較，穴位注射組與中藥組的全血黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞壓積均顯著降低，TT、APTT明顯延長(zhǎng)，F(xiàn)IB含量明顯減少。穴位注射組和中藥組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示穴位注射有類似桃紅四物湯活血化瘀的作用。

《醫(yī)方考》云：“新血生則瘀血滑而易去”，祛瘀生新是活血化瘀的高層次,包括活血化瘀以及血管新生兩方面。血管內(nèi)皮細(xì)胞是“祛瘀生新”的主要執(zhí)行者之一，通過(guò)釋放信號(hào)分子調(diào)節(jié)其血管狀態(tài)，從而達(dá)到“祛瘀新生”的作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞是體內(nèi)合成NO的主要細(xì)胞，NO是重要的血管舒張因子，入血液的NO可抑制血小板聚集[14]。因此，血清NO是評(píng)價(jià)丹紅穴位注射和桃紅四物湯干預(yù)效果的最重要祛瘀指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組NO含量顯著下降；與模型組比較，穴位注射組和中藥組NO含量顯著增加，驗(yàn)證了NO舒張血管功能，提示穴位注射與桃紅四物湯類似，均可以上調(diào)血清NO。然而血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、血管的形成和血管的功能是由VEGF緊密調(diào)節(jié)的，其受體KDR主要介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，引起血管通透性升高，并有抗細(xì)胞凋亡維持內(nèi)皮細(xì)胞存活效應(yīng)，在血管生成過(guò)程中的作用十分重要[15]。VEGF是促進(jìn)血管生成的重要因子，可通過(guò)與KDR結(jié)合，激活PI3K/Akt途徑，從而上調(diào)NOS的表達(dá)，誘導(dǎo)釋放出NO；NO也可以通過(guò)PI3K/Akt促進(jìn)VEGF/KDR合成，起到正反饋的作用[16]。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，與模型組比較，穴位注射組、中藥組均能促進(jìn)子宮組織VEGF/KDR mRNA及蛋白的表達(dá)。穴位注射組與中藥組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示穴位注射有類似桃紅四物湯的作用，能有效活血化瘀，更能升高血清NO、促進(jìn)子宮VEGF/KDR mRNA及蛋白的表達(dá)，以達(dá)到祛瘀生新的作用。

綜上所述，丹紅穴位注射治療氣滯血瘀證可能的作用機(jī)制是血清NO、VEGF、KDR為改善子宮組織血流狀態(tài)最重要因子，三者相互促進(jìn)從而達(dá)到“祛瘀生新”的作用。本研究對(duì)氣滯血瘀證的本質(zhì)、祛瘀與生新的關(guān)系、丹紅穴位注射改善氣滯血瘀證的作用機(jī)制等方面的研究具有重要意義,為臨床運(yùn)用丹紅穴位注射治療氣滯血瘀證女性疾病證候提供一定的理論依據(jù)。