“李氏薄貼”對荷瘤小鼠的抑瘤作用及促凋亡機制研究?

肖 寒，方乃青，奚柯婧，秦 艷，李慧剛

(1. 江南大學附屬醫(yī)院，江蘇 無錫 214062； 2. 江蘇省無錫市錫山區(qū)查橋社區(qū)衛(wèi)生服務中心，江蘇 無錫 214062)

中國是肝癌高發(fā)地區(qū)，GLOBOCAN 2012統(tǒng)計顯示，全世界50%的肝癌發(fā)生于中國，高發(fā)區(qū)主要集中在江蘇、浙江、福建等東南沿海地區(qū)[1]。由于臨床癥狀不典型，發(fā)現(xiàn)時中晚期患者居多，且肝癌對放化療不敏感，治療手段較少，預后差[2]?！袄钍媳≠N”是經四代醫(yī)者100多年的共同努力，參照唐代《千金翼方》中的有關處方，遵循中醫(yī)學辨證與辨病相結合的原則，在民間秘方“消腫止痛膏”的基礎上不斷完善、創(chuàng)新發(fā)展起來的外用方劑，在2010年被無錫市人民政府批準為非物質文化遺產保護項目。主要由中藥莪術、參三七、山慈菇、大黃等4味藥物組成。在臨床應用中，使許多原發(fā)性肝癌患者能控制腫瘤，減輕痛苦，緩解癥狀，延長生命，提高生活質量。本研究應用動物模型對“李氏薄貼”的抗肝癌作用機制進行研究，為進一步開發(fā)利用奠定了實驗依據。

1 材料

1.1 試驗藥物

“李氏薄貼”外用膏藥由“李氏薄貼”傳承人李慧剛配制。藥物組成：山慈菇8 g，莪術8 g，參三七5 g，大黃5 g，購自江南大學附屬醫(yī)院中藥房，并由藥房加工成100目的藥粉，按照1∶2的比例將藥粉與黑藥肉混合加熱至60°，涂于塑料薄膜上固定成外用膏藥，切制成2×2 cm外用膏藥，低劑量組每張2×2 cm膏藥含生藥量0.3 g(折算成實驗小鼠用量為15 g/kg)，高劑量組每張2×2 cm膏藥含生藥量0.6 g(折算成實驗小鼠用量為30 g/kg)。氟尿嘧啶注射液由天津金耀藥業(yè)有限公司提供(批號H12020959)。

1.2 動物

SPF級昆明種小鼠46只，其中雌雄各23只，20只雌性以及20只雄性小鼠分組供實驗用，另6只小鼠供H22瘤株傳代用，每只小鼠重約 (20±2) g，購自江南大學動物實驗中心(許可證號SYXK(蘇)2016-0044)。在江南大學動物實驗中心飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)于溫度18～22 ℃、濕度50%～60%環(huán)境中，給予自由攝食和飲水，提供消毒普通顆粒飼料。

1.3 細胞系

小鼠肝癌 H22 細胞株，購自上海酶研生物科技有限公司。

1.4 試劑及儀器

TUNEL法細胞凋亡試劑盒(批號MK1020)、一抗Bcl-2(批號BM4985)、一抗Bax(批號BA0315-1)及一抗Caspase-3(批號BM4620)均購于武漢博士德生物工程有限公司；蘇木素-伊紅染液(武漢谷歌生物科技有限公司)；OLYMPUS BX43雙目生物攝像顯微鏡(日本)；JJ-12 J 型脫水機、包埋機(武漢俊杰電子有限公司)；RM2013 病理切片機(上海徠卡儀器有限公司)；酶標儀(上海研卉生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 H22肝癌小鼠模型的制備

根據參考文獻進行造模[3]，首先進行H22肝癌細胞株復蘇、培養(yǎng)擴增，調整細胞懸液密度至1×107個/ml，抽取上述細胞懸液0.2 ml注入6只昆明種小鼠腹腔，7 d后抽取腹水，將腹水離心(1200 r/min 5 min)后留取下層含細胞液體。

除模型對照組外，其他3組小鼠在術前禁食12 h，手術前20 min使用10%水合氯醛進行腹腔注射麻醉，劑量為 3.5 ml/kg。在無菌操作臺上，將麻醉后的小鼠仰臥位固定于手術板，沿腹正中線逐層切開，手術切口1 cm左右暴露肝臟，用1 ml 注射器抽取含H22肝癌細胞液體，針頭斜刺入肝臟，注入0.05 ml逐層縫合關腹，仔細觀察小鼠術后恢復情況，4 d后開始用藥。

2.2 給藥方法

將40只荷瘤小鼠按隨機數字表法分為模型對照組、陽性對照組、低劑量組、高劑量組4組各10只，腹部皮膚表面脫毛處理。其中低劑量組、高劑量組將“李氏薄貼”外用膏藥貼敷于腹部肝區(qū)，每3 d更換，連續(xù)9 d。陽性對照組給予氟尿嘧啶注射液浸潤的2×2 cm膠布外貼(內層為含氟尿嘧啶注射液紗布)，每日1次，連續(xù)9 d。模型對照組給予0.9 %氯化鈉外用，每日1次，連續(xù)9 d。9 d后處死小鼠，切取肝臟腫瘤組織稱重。計算抑瘤率：抑瘤率=(模型對照組腫瘤質量-藥物組腫瘤質量)/模型對照組腫瘤質量×100%。

2.3 觀察指標及檢測方法

2.3.1 HE染色觀察細胞學形態(tài) 使用10%中性甲醛溶液將小鼠肝臟腫瘤組織固定12 h，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片，烘箱內烘干，使用HE染色法染色，光鏡下觀察細胞學形態(tài)。

2.3.2 TUNEL法檢測細胞凋亡 使用二甲苯對石蠟切片進行2次脫蠟各5～10 min，按順序放入無水乙醇5 min。接著放入90%乙醇、70%乙醇、蒸餾水各2 min，3%過氧化氫甲醇中浸洗10 min。滴加20 μg/ml蛋白酶K，在室溫下孵育20 min。PBS洗滌5 min，連續(xù)3次。滴加50 μl的TUNEL反應混合液，37 ℃孵育60 min。PBS洗滌3次，每次5 min×3次，加入50 μl轉化劑POD后在濕盒中37 ℃孵育25 min。PBS沖洗后加入50 μlDAB底物溶液，室溫孵育10 min，PBS洗滌3次，中性樹膠封片后光鏡下分析結果。陽性細胞標準為細胞核內出現(xiàn)棕褐色顆粒，每個視野計數200個細胞，每個實驗組選取10個視野，按照公式：凋亡指數=陽性細胞數/總細胞數×100%，計算細胞凋亡指數。

2.3.3 免疫組化方法檢測腫瘤組織中Bax(Bcl-2基因相關蛋白X)、Caspase-3(半胱氨酸蛋白酶-3)、Bcl-2(B細胞性淋巴瘤/白血病-2基因)的表達情況 免疫組化檢測使用SP三步法，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。石蠟包埋的腫瘤組織切片、脫蠟水化，PBS緩沖液沖洗后利用微波爐進行抗原修復，自然冷卻后加3%H2O2室溫下孵育。PBS沖洗后加入一抗，經孵育沖洗后加入二抗，DAB 染色，蘇木素復染后常規(guī)脫水、透明、干燥、封片，在光學顯微鏡下觀察胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆?；蜃睾稚w粒細胞為陽性細胞。采用圖像處理分析軟件Image-Pro Plus 6.0對Bax、Caspase-3、Bcl-2的表達進行定量分析，計算并得出平均光密度值(IOD/Area)進行統(tǒng)計分析。

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 各組小鼠抑瘤率分析

表1圖1示，“李氏薄貼”低劑量組以及高劑量組和模型對照組比較，腫瘤組織質量均有降低，其中高劑量組和模型對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與使用氟尿嘧啶陽性對照組比較，高劑量組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明高劑量組與氟尿嘧啶一樣能抑制腫瘤生長，而“李氏薄貼”低劑量組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明低劑量組抑制腫瘤生長效果欠佳?！袄钍媳≠N”高劑量組、低劑量組抑瘤率分別為38.97%、13.47%，提示“李氏薄貼”可抑制腫瘤生長，其中高劑量組效果較好。

表1 各組小鼠瘤重與抑瘤率分析比較

3.2 HE染色結果

圖2示，模型對照組的病理切片中，藍色的為染色后的細胞核，紅色為細胞漿，細胞結構清晰，形態(tài)不規(guī)則，呈現(xiàn)多邊形，核較正常細胞大且形態(tài)各異，可見較多的核分裂，核漿比例失調，毛細血管豐富，部分區(qū)域存在壞死組織，說明肝癌細胞生長迅速?！袄钍媳≠N”高劑量組圖中可見，細胞漿腫脹呈空泡狀，細胞核固縮、壞死，毛細血管數量明顯減少，血管腔變細，說明腫瘤細胞有一定程度的凋亡?！袄钍媳≠N”低劑量組圖中可見少量細胞漿呈空泡狀，少量細胞核固縮、壞死，說明腫瘤細胞凋亡程度較輕。陽性對照組與高劑量組相類似，細胞漿腫脹明顯，可見到大量細胞核固縮、壞死，說明細胞凋亡程度高。

3.3 TUNEL檢測結果

圖2B組圖片示，光鏡下發(fā)現(xiàn)模型對照組幾乎沒有陽性細胞(細胞核顯棕黃色的凋亡細胞)，細胞排列緊密呈藍色，低劑量組偶可見陽性細胞，而陽性對照組以及高劑量組出現(xiàn)大量棕黃色陽性細胞。表2示，通過凋亡指數的統(tǒng)計，與陽性對照組比較，低劑量組凋亡指數處于低水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而高劑量組與陽性對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與模型對照組比較，低劑量組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但高劑量組凋亡指數明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明高劑量組和化療藥物氟尿嘧啶一樣具有較強的促進細胞凋亡作用，而低劑量組促細胞凋亡作用較弱。

3.4 腫瘤組織中Bcl-2、Bax及Caspase-3的表達差異

表2圖4示，與模型對照組比較，“李氏薄貼”高劑量組Bcl-2表達水平明顯降低(P<0.05)，無論是“李氏薄貼”高劑量組還是低劑量組Bax、Caspase-3凋亡相關蛋白的表達都是顯著增加，其平均光密度值(IOD/Area)顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)。與陽性對照組比較，“李氏薄貼”低劑量組Bax、Caspase-3表達水平明顯下降，Bcl-2表達水平增加(P<0.05)，而“李氏薄貼”高劑量組與陽性對照組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明高劑量組引起細胞凋亡程度與陽性對照組相當，而低劑量組由于劑量的關系，凋亡相關蛋白表達程度與陽性對照組比較還有一定差異。這一結果提示“李氏薄貼”可以通過降低抑凋亡蛋白Bcl-2表達，提高促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達以達到促進肝癌細胞線粒體途徑凋亡，且具有一定的量效關系。

表2 各組小鼠凋亡指數及凋亡相關蛋白表達差異比較

4 討論

“李氏薄貼”由莪術、參三七、山慈菇、大黃、大戟等數十味主要藥物組成，其中山慈菇、莪術、參三七3味為主要藥物。山慈菇的功效為清熱解毒，消癰散結，在臨床上主要用于治療癰腫、瘰疬、疔毒、淋巴結核等[4]。經現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，山慈菇的提取物對結腸癌(HCT-8)、肝癌(Be17402)、胃癌(BGC-823)、肺癌(A549)、乳腺癌(MCF-7)和卵巢癌(A2780)細胞表現(xiàn)出非選擇性中等強度的細胞毒活性，能有效抑制血管內皮祖細胞管腔形成和細胞遷移，它是一種新的抗血管生成抑素，應用于血管增生性視網膜病變和腫瘤的治療[5]。莪術油是常用的抗腫瘤中藥材莪術的提取物，它可以促進人子宮內膜癌細胞凋亡，作用機制為上調凋亡相關bax基因，以及下調bcl-2基因，促凋亡作用與濃度以及時間成正比[6-7]。三七總皂苷是一種多靶點抗腫瘤中藥，其特點是高效低毒，也就是說它對正常組織細胞毒性低，對腫瘤細胞毒性高，有直接殺傷和抑制腫瘤細胞生長的作用，能誘導腫瘤細胞凋亡，同時可以增強機體免疫功能等多重機制抗腫瘤[8]。由此可見，“李氏薄貼”的主要成分均具有一定的抗腫瘤作用。

細胞凋亡存在兩條主要信號通路[9-12]，一條為內在的線粒體通路和另一條為外在的死亡受體信號通路。在線粒體通路中，當凋亡刺激因素作用下，可引起線粒體外膜通透性增加，細胞色素c從線粒體

釋放入胞質，引發(fā)caspases級聯(lián)反應，從而誘發(fā)細胞凋亡。其中，bcl-2家族蛋白是在線粒體凋亡通路中起重要調控作用的一類蛋白。Bcl-2家族蛋白按功能可分為促進和抑制細胞凋亡兩大類成員，即具有抑制凋亡作用的蛋白有Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W等，具有促進凋亡作用的有Bax、Bd-Xs等。胞外的死亡信號可通過Fas等死亡受體轉入胞內[13-14]。Fas是細胞表面重要的死亡受體，細胞在接收到經Fas傳遞的凋亡信號后，可以通過Fas I型通路和Fas II型信號通路引發(fā)細胞凋亡。Fas受體介導的caspase-8的量不足以直接激活凋亡執(zhí)行酶caspase-3。因此這類細胞中的凋亡信號需要借助凋亡的線粒體通路來放大，線粒體為啟動下游的凋亡執(zhí)行環(huán)節(jié)caspase級聯(lián)反應提供放大信號。外源性和內源性凋亡途徑最終都依賴caspase-3的激活，它是細胞凋亡的關鍵性執(zhí)行分子，caspase-3一旦被激活細胞凋亡則不可避免。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，“李氏薄貼”高劑量組能抑制荷瘤小鼠腫瘤生長，在光鏡下有細胞凋亡的表現(xiàn)。TUNEL法檢測發(fā)現(xiàn)，其凋亡指數高于低劑量組，與陽性對照組相當，說明“李氏薄貼”能通過誘導肝癌細胞凋亡而起到抑制肝癌的作用。但它是通過什么途徑發(fā)揮作用的呢？進一步利用免疫組化方法對腫瘤組織進行染色發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織Bax、Caspase-3表達上調、Bcl-2下調，推測該藥是通過增加Bax及Caspase-3的表達、抑制Bcl-2的表達來發(fā)揮抑瘤效應的。這一實驗結果恰好說明“李氏薄貼”的作用機制與線粒體途徑引起肝癌細胞凋亡相關。下一步研究將進一步對“李氏薄貼”從分子及基因水平驗證其作用機制是否存在其他作用途徑，為產品開發(fā)提供理論依據。