基于UPLC/Q-TOF MS/MS的穩(wěn)心顆粒主要成分分析及鑒定*

李曉鳳，張少?gòu)?qiáng)，劉金彪，裴麗敏，孫立麗，周 博，杜武勛

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300250；2.天津理工大學(xué)，天津 300384；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；4.山東步長(zhǎng)制藥股份有限公司，荷澤 274005）

中藥復(fù)方多靶點(diǎn)、多途徑的治療特點(diǎn)，與復(fù)方多靶點(diǎn)、多機(jī)制的病機(jī)特點(diǎn)相得益彰。心律失常是心血管領(lǐng)域常見、復(fù)雜疾病，惡性心律失常是心血管疾病重要致死因素。心律失常發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尤其是心律失常抑制（CAST）試驗(yàn)表明單通道、單靶點(diǎn)的治療模式往往會(huì)帶來更加嚴(yán)重的心律失常事件。理想的抗心律失常藥物應(yīng)對(duì)心臟多個(gè)離子通道靶點(diǎn)有作用，并且對(duì)每個(gè)通道的作用都比較溫和，不過度抑制某一個(gè)或幾個(gè)離子通道，并有益于離子通道之間平衡的恢復(fù)[1]。而中藥復(fù)方存在多靶點(diǎn)、多通道的特點(diǎn)與優(yōu)勢(shì)，與心律失常理想治療原則不謀而合。以穩(wěn)心顆粒為代表的中藥復(fù)方在抗心律失常方面療效顯著，且安全性高，臨床常用中成藥未見致心律失常等不良反應(yīng)的報(bào)道，是理想的抗心律失常藥。穩(wěn)心顆粒由黨參、黃精、三七、琥珀、甘松5味中藥組成，主要功效為活血化瘀、定悸復(fù)脈、益氣養(yǎng)陰，對(duì)心脈瘀阻所致的胸悶胸痛、氣短乏力、心悸不寧等癥狀有良好的治療效果。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)穩(wěn)心顆?；瘜W(xué)成分進(jìn)行了相關(guān)研究，例如張家偉等[2]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法測(cè)定大鼠灌服穩(wěn)心顆粒后血漿中3個(gè)皂苷成分的濃度，并研究其藥物動(dòng)力學(xué)特征。李啟艷等[3]用快速溶劑萃取-超高效液相色譜法測(cè)定穩(wěn)心顆粒中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的含量。柳江紅等[4]采用X射線衍射傅里葉指紋圖譜法，建立穩(wěn)心顆粒制劑的鑒定分析新方法。但上述研究或集中于穩(wěn)心顆粒某類單一成分（主要是皂苷類），并未對(duì)穩(wěn)心顆粒全部成分進(jìn)行分析；或未分析其具體成分。復(fù)方干預(yù)復(fù)雜疾病研究的基礎(chǔ)是明確復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，復(fù)方藥效整體藥物配伍組合的綜合效應(yīng)，故本研究利用超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC/Q-TOF MS/MS）技術(shù)，分析穩(wěn)心顆粒水溶液成分，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，分析主要成分的藥效機(jī)制，從而篩選出穩(wěn)心顆粒治療心律失常的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 主要儀器與試劑

Acquity TM UPLC液相儀（美國(guó)Waters公司），Synapt TM High DefinitionMS（HDMS）System 質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司），ACQUITYUPLCBEHC18（2.1mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱（美國(guó) Waters公司），MIKRO 220RS/N0000346-01-00高速離心機(jī)（德國(guó)Hettich公司），色譜純乙腈（Fisher，美國(guó)，071757），甲醇（Fisher，美國(guó)，154449），甲酸（CNW，德國(guó)，3208K240）、純凈水（農(nóng)夫山泉），穩(wěn)心顆粒（山東步長(zhǎng)制藥股份有限公司，批號(hào)：1805106）。

2 方法

2.1 穩(wěn)心顆粒溶液制備 將穩(wěn)心顆粒按0.5 g/10 mL溶于純凈水中，超聲溶解，離心半徑為87 mm，10 000 r/min離心10 min，得上清液。稀釋4倍后0.22 μm微孔濾膜過濾。

2.2 色譜條件 色譜柱：ACQUITYUPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流速：0.3 mL/min；柱溫：45℃；室溫：4℃；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B）（含體積比 0.1%甲酸），梯度洗脫（0 min，2%B；6 min，22%B；10 min，30%B；14～18 min，38%B；22 min，60%B；26～28 min，100%B；29～30 min，2%B）；進(jìn)樣量：5 μL。

2.3 質(zhì)譜條件 采用電噴霧電離源（ESI源），正離子（Positive）/負(fù)離子（Negative）雙模式檢測(cè)，ESI源溫度分別為 120℃（Positive）/110℃（Negative），脫溶劑和霧化氣為高純N2，錐孔N2反吹流量50L/h，電壓40 V；毛細(xì)管電壓 3.0 kV（Positive）/2.0 kV（Negative）；N2溫度 450 ℃（Positive）/280 ℃（Ngeative），流量800 L/h；分子量范圍50～1 200 Da；采樣頻率0.1 s，間隔0.02s；掃描時(shí)效30min；全信息串聯(lián)質(zhì)譜（MSE）采集模式，碰撞能量25 V。LockMass采用亮氨酸-腦啡肽 LE，其 m/z為[M+H]+=556.277 1、[M-H]-=554.261 5，對(duì)檢測(cè)樣品分子量進(jìn)行實(shí)時(shí)校正。

2.4 數(shù)據(jù)分析 采用WatersMassLynxV4.1軟件進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

穩(wěn)心顆粒水溶液Positive/Negative模式下BPI圖，見圖1。經(jīng)Waters MassLynxV4.1軟件分析，共鑒定68個(gè)化合物，其中有24個(gè)成分ppm≤3，見表1。

根據(jù)復(fù)方中各味中藥的名稱，查閱《中藥質(zhì)量現(xiàn)代分析技術(shù)》、相關(guān)有效成分文獻(xiàn)報(bào)道，并參考TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）及 PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），確定可能含有的每味中藥的有效成分，記錄下對(duì)應(yīng)分子式。利用液質(zhì)工作站自帶分子量計(jì)算軟件MassLynx，分別計(jì)算出有效成分的 M、M+H、M+Na、M-H、M+HCOOH精確分子量，如三七皂苷R1，M=932.534，[M+H]+=933.542 6，[M+Na]+=955.524 5，[M-H]-=931.526 9，[M+HCOO]-=977.532 4。在 MassLynx軟件中調(diào)用Positive液相色譜圖TIC格式，并轉(zhuǎn)換成BPI格式，利用分子量檢索功能提取正離下母離子峰，如三七皂苷R1為933.54和955.52，分子量提取窗口寬度為0.02。如果樣品液相圖譜中有目標(biāo)化合物的母離子峰，就會(huì)在相應(yīng)的出峰位置出現(xiàn)色譜峰，根據(jù)信號(hào)峰的強(qiáng)弱初步判斷是否有該化合物。采用相同方法對(duì)Negative模式下物質(zhì)進(jìn)行處理。如果色譜圖中有一個(gè)比較明顯的特征峰，Positive/Ngeative下出峰時(shí)間基本相同，兩者分子量相差2，基本可以確定是同一物質(zhì)的Positive/Ngeative峰。根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜圖結(jié)合化合物結(jié)構(gòu)式確定可能的離子碎片，推測(cè)化合物的裂解途徑。如果色譜圖中出現(xiàn)兩個(gè)或者兩個(gè)以上色譜峰，且分子量基本完全相同，結(jié)構(gòu)式推測(cè)結(jié)果可能是同分異構(gòu)體（三七藥材中含有較多同分異構(gòu)體），根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜的碎片特征推測(cè)裂解途徑，或者根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)、對(duì)照品及文獻(xiàn)檢索查看化合物的碎片，確定化合物結(jié)構(gòu)。

4 討論

本研究首次利用UPLC/Q-TOF MS/MS技術(shù)，對(duì)穩(wěn)心顆粒水溶液成分進(jìn)行初步分析，共有效表征了該復(fù)方中68個(gè)化學(xué)成分，主要包括糖類、皂苷類、黃酮類、揮發(fā)油類，其中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1豐度較高。

本研究所鑒定的68個(gè)成分中，來自三七的30個(gè)成分主要屬于皂苷類。實(shí)驗(yàn)研究顯示三七皂苷可直接抑制心肌作用，有效治療各種藥物誘發(fā)的心律失常[5]。三七皂苷、人參皂苷Rb1還具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛[6]、改善肝臟微循環(huán)[7]、延緩衰老[8]等作用。

有11個(gè)成分主要來源于甘松，其主要成分為揮發(fā)油和萜類成分，后者又以倍半萜種類最多，可以激活竇房結(jié)及周圍組織，清除代謝產(chǎn)物，抑制異位性室性期前收縮、損傷性心房撲動(dòng)等快速性心律失常，其安全性高，毒副作用小[9]。甘松中丹參酮ⅡA可以抑制過表達(dá)的血清反應(yīng)因子（SRF），抑制miR-1的過表達(dá)，恢復(fù)由于過表達(dá)miR-1抑制KCND2的表達(dá)，恢復(fù)Kv4.2蛋白的表達(dá)，改善鉀通道功能紊亂[10]。

有16個(gè)成分主要來源于黃精，主要含糖類、氨基酸及多種黃酮類、蒽醌類化合物，具有強(qiáng)心、提高免疫力[11-12]、抗衰老[13]、降低血脂、降低血糖、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等多種藥理作用[14-16]。有研究顯示其最具心血管活性的物質(zhì)為一些苷類及苷元[17]，如（+）-松脂素-O-β-D-吡喃葡糖糖基（1→6）-β-D-吡喃葡糖糖苷、（+）-丁香脂素-O-β-D-吡喃葡糖糖苷、滇黃精苷A、滇黃精苷C等，可抗動(dòng)脈粥樣硬化。

圖1 UPLC/Q-TOF MS/MS Positive/Negative模式下一級(jí)總離子流圖譜（BPI）Fig.1 Primary total ion flow diagram(BPI)in UPLC/Q-TOF MS/MS Positive/Negative ion mode

有16個(gè)成分主要來源于黨參，黨參具有抗氧化作用[18]，而冠心病等心腦血管疾病與缺氧有關(guān)，顯示黨參在心腦血管疾病的治療上有應(yīng)用前景[19]。

綜上，甘松有著直接抗心律失常作用，在穩(wěn)心顆粒抗心律失常作用中為君藥。本研究中所檢測(cè)出的主要成分為皂苷類成分，主要源自三七，是抗心律失常、保護(hù)心血管系統(tǒng)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，故三七為臣藥。穩(wěn)心顆粒抗心律失常作用與黃精強(qiáng)心、提高免疫力、抗氧化、抑制炎癥等藥理作用以及黨參的抗氧化、增強(qiáng)心肌耐氧作用、抗炎等藥理作用密切相關(guān)，兩者乃佐藥之用。

5 不足與展望

本實(shí)驗(yàn)在沒有對(duì)照品的情況下，通過UPLC/QTOF MS/MS技術(shù)對(duì)中藥復(fù)方進(jìn)行了化學(xué)成分的分析和鑒定，說明該技術(shù)非常適合于中藥復(fù)方成分的定性分析。但是，也正是由于缺少對(duì)照品，部分同分異構(gòu)體或者相似母核的化合物無法確定其具體結(jié)構(gòu)，在今后的實(shí)驗(yàn)中還要結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)這些成分進(jìn)行鑒別。

表1 穩(wěn)心顆粒中推測(cè)化合物的質(zhì)譜信息Tab.1 Basic information about presumed compounds in Wenxin Granules

續(xù)表1