基于JAK1/STAT6通路探討安腸愈瘍湯對HT-29細(xì)胞炎癥模型的影響及機制研究*

孫大娟 ，樊靜娜 ，王 帥 ，遲莉麗

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，濟南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，濟南 250014）

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病[1]。目前認(rèn)為UC的發(fā)病是由遺傳易感性、環(huán)境因素、自身免疫調(diào)節(jié)失衡、腸道菌群紊亂等多方面因素相互影響共同作用引起的腸黏膜屏障損傷[2]，故 Giovanni又稱 UC 為“屏障器官性疾病”[3]。腸道黏膜屏障的完整性在UC的發(fā)病機制中起著重要作用，故修復(fù)損傷的腸道黏膜屏障是治療UC的關(guān)鍵所在。安腸愈瘍湯是導(dǎo)師遲莉麗教授臨證治療UC總結(jié)的經(jīng)驗方，具有健脾益氣、清解化濕、調(diào)氣活血的功效，臨床療效顯著[4-5]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)安腸愈瘍湯可明顯下調(diào)UC大鼠致炎因子白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-8、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達(dá)，上調(diào)抗炎因子IL-10、IL-13的表達(dá)，上調(diào)腸黏膜修復(fù)因子腸三葉因子（TFF3）、黏蛋白 2（MUC2）的表達(dá)，具有較好的抗炎及促進(jìn)黏膜修復(fù)的作用[6-9]。但是對于安腸愈瘍湯調(diào)控TFF3分子的上游調(diào)控通路研究尚不明確，有研究表明蛋白酪氨酸激酶1（JAK1）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子 6（STAT6）信號通路廣泛參與細(xì)胞生長、分化、增殖、炎癥和調(diào)節(jié)免疫功能等過程，在UC的發(fā)病中調(diào)控著重要的免疫應(yīng)答反應(yīng)[10-13]。本實驗在前期研究基礎(chǔ)上，使用脂多糖（LPS）誘導(dǎo)建立人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞（HT-29細(xì)胞）炎癥模型，從體外實驗觀察安腸愈瘍湯對JAK1/STAT6通路的影響，并探討其作用機制。

1 材料

1.1 細(xì)胞 HT-29細(xì)胞（上海中橋新舟生物科技有限公司，批號：Cat.#ZQ0057）。

1.2 藥物制備 安腸愈瘍湯（生黃芪30 g，炒白術(shù)30 g，薏苡仁 30 g，敗醬草 30 g，黃連 9 g，黃芩 9 g，木香 9 g，檳榔 15 g，地榆炭 15 g，白及 12 g，當(dāng)歸9 g，炒白芍 12 g，防風(fēng) 6 g，生甘草 9 g）藥材購于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，煎煮、過濾、濃縮后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)至濃稠不流動狀態(tài)，烘干制成浸膏。稱量后完全溶解于DMEM培養(yǎng)基中，使用無菌注射器取溶解后液體通過0.22 μm濾膜除菌制成無菌藥品溶液，干預(yù)時使用DMEM培養(yǎng)基配置成相應(yīng)濃度的含藥培養(yǎng)基進(jìn)行孵育。5-氨基水楊酸（5-AS，商品名：美沙拉秦，批號：Cat.SA5260，Lot.518A021，購自北京索萊寶科技有限公司）溶解于二甲基亞砜（DMSO），后溶解于DMEM培養(yǎng)基中再配置成相應(yīng)濃度進(jìn)行干預(yù)。

1.3 試劑 四甲基噻唑藍(lán)MTT（批號：Lot.#303H0525，購自北京索萊寶科技有限公司），PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser[Perfect Real Time，批號：Cat.#RR047A，Lot.#AI12361A，購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司（takara中國）]，辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（批號：Cat.#ZB-2301，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），人類IL-13、TFF3酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（批號分別為：Cat.E-EL-H0104c，Lot.3YVV1HYY3U 及 Cat.E-ELH1108c，Lot.LRQW8J1JW6，購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司），兔多克隆IL-13、JAK1抗體（批號分別為：ab106732、ab47435，購自英國Abcam公司），兔單克隆STAT6、TFF3抗體（批號分別為：ab32520、ab108599，購自英國 Abcam 公司）；異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）（H+L）（批號：Cat.A0562，購自上海碧云天生物科技有限公司）；4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液（批號：Cat.C1005，購自上海碧云天生物科技有限公司）。

1.4 儀器 EVOSTMFLoid倒置熒光顯微鏡（購自美國 Thermo Fisher Scientific公司），Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra電泳系統(tǒng)（購自美國Bio-Rad公司），F(xiàn)luor Chem Q蛋白印跡成像和定量分析系統(tǒng)（購自美國Protein simple公司），Light Cycler 480Ⅱ熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（購自德國Roche公司）。本研究在山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實驗中心完成。

2 方法

2.1 HT-29細(xì)胞炎癥模型建立 HT-29細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，加入LPS 20 μg/mL[14-15]孵育 24 h（LPS 組），以未經(jīng) LPS 處理的細(xì)胞作為對照組。提取核糖核酸（RNA）應(yīng)用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Q-RT-PCR）技術(shù)檢測IL-8、IL-13 mRNA的表達(dá)。

2.2 安腸愈瘍湯濃度的篩選 在前期研究基礎(chǔ)上，安腸愈瘍湯分設(shè) 0.01、0.1、1、5、10、25、50 mg/mL 7個濃度梯度，以正常未處理HT-29細(xì)胞為對照組，采用MTT法觀察不同濃度安腸愈瘍湯對HT-29活力的影響，并采用Q-RT-PCR法檢測IL-8 mRNA表達(dá)變化。

2.3 分組及干預(yù) 實驗細(xì)胞分為6組，空白組：加入完全培養(yǎng)基孵育，不做任何處理；模型組：給予LPS（20 μg/mL）干預(yù) 24 h；安腸愈瘍湯各濃度組：LPS（20 μg/mL）干預(yù) 24 h 后再給予安腸愈瘍湯（低、中、高濃度）孵育 24 h；5-AS 組：LPS（20 μg/mL）干預(yù)24 h后再給予5-AS（1 mg/L）孵育24 h。

2.4 應(yīng)用ELISA法檢測各組IL-13、TFF3的分泌水平 取細(xì)胞培養(yǎng)上清1 000×g離心20 min，取上清液，根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測IL-13、TFF3的表達(dá)水平。

2.5 應(yīng)用免疫熒光檢測各組IL-13、TFF3的熒光強度 各組以1×104/孔細(xì)胞密度接種到鋪好細(xì)胞爬片的24孔板內(nèi)，干預(yù)24 h后棄培養(yǎng)基，多聚甲醛固定、TritonX-100通透、山羊血清封閉，每孔加入一抗（1∶200），濕盒4℃孵育過夜，F(xiàn)ITC標(biāo)記的二抗室溫避光孵育1 h，DAPI染核5 min，抗熒光衰減封片劑封片后于熒光顯微鏡下采集圖像，應(yīng)用Image J軟件分析抗體表達(dá)。

2.6 Q-RT-PCR 檢測各組 IL-13、JAK1、STAT6、TFF3 mRNA的表達(dá) 收集干預(yù)24 h的細(xì)胞，按Trizol說明書提取細(xì)胞總RNA，按照cDNA合成試劑盒說明書合成cDNA模板，以此cDNA模板采用Light Cycler 480Ⅱ熒光定量PCR儀進(jìn)行擴增，以GAPDH作為對照，采用2-ΔΔCt法計算組間對應(yīng)基因的表達(dá)差異。實驗用各引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.7 應(yīng)用蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測IL-13、JAK1、STAT6、TFF3蛋白的表達(dá) 提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，制備蛋白上樣緩沖液，配制SDS-PAGE凝膠，取等量蛋白電泳，濕轉(zhuǎn)、封閉后放入到 IL-13（1∶1 000）、TFF3（1∶5 000）、JAK1（1∶2 000）、STAT6（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）的一抗孵育盒中4℃過夜，次日洗膜，室溫孵育二抗1 h，洗膜。發(fā)光液顯色，凝膠系統(tǒng)成像。使用Image J軟件分析條帶灰度值。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較若方差齊采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，多組間比較若方差不齊采用秩和檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 HT-29細(xì)胞炎癥模型的建立 與對照組比較，模型組細(xì)胞IL-8 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01），IL-13 mRNA 表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.01），說明炎癥模型建立成功，見表2。

表2 LPS誘導(dǎo)的 HT-29細(xì)胞 IL-8、IL-13的表達(dá)（±s）Tab.2 The expression of IL-8，IL-13 in HT-29 cells induced by LPS（±s）

表2 LPS誘導(dǎo)的 HT-29細(xì)胞 IL-8、IL-13的表達(dá)（±s）Tab.2 The expression of IL-8，IL-13 in HT-29 cells induced by LPS（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01。

組別對照組模型組IL-8 IL-13 1.00±0.11 1.00±0.06 10.89±1.80* 0.27±0.04*

3.2 不同濃度安腸愈瘍湯對HT-29細(xì)胞活力的影響 與對照組比較，模型組對HT-29細(xì)胞具有明顯促增殖作用（P＜0.01）；與模型組相比，安腸愈瘍湯在濃度為 0.01、0.1、1、5、10 mg/mL 時對 HT-29 具有明顯的促增殖作用（P＜0.01），在 25、50 mg/mL 時有抑制作用（P＜0.01）。0.01、0.1、10 mg/mL 3 組組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），0.1 mg/mL 與 1 mg/mL組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。1 mg/mL組與5 mg/mL組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。選擇安腸愈瘍湯0.1、1、10 mg/mL進(jìn)行后續(xù)實驗，見表3。

分別采用安腸愈瘍湯0.1、1、10 mg/mL濃度干預(yù)LPS誘導(dǎo)的HT-29 24 h后，采用Q-RT-PCR檢測IL-8 mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示：與對照組比較，模型組IL-8 mRNA表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）；與模型組比較，安腸愈瘍湯 0.1、1、10 mg/mL組表達(dá)均下調(diào)（P＜0.01）；3組間兩兩比較有差異（P＜0.01）。因此選取0.1、1、10 mg/mL 為后期實驗低、中、高濃度，見表 4。

表3 不同濃度安腸愈瘍湯對HT-29細(xì)胞活力的影響（±s）Tab.3 Cell viability of HT-29 cells with different concentrations of AYR（±s）

表3 不同濃度安腸愈瘍湯對HT-29細(xì)胞活力的影響（±s）Tab.3 Cell viability of HT-29 cells with different concentrations of AYR（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；與安腸愈瘍湯0.01 mg/mL組比較，▲P＜0.01；與安腸愈瘍湯0.1 mg/mL組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別 n OD562對照組 3 0.53±0.02模型組 3 0.75±0.03*安腸愈瘍湯0.01 mg/mL組 3 0.81±0.04#安腸愈瘍湯 0.1 mg/mL 組 3 0.88±0.04#▲安腸愈瘍湯 1 mg/mL 組 3 0.93±0.04#△安腸愈瘍湯5 mg/mL組 3 0.94±0.05#安腸愈瘍湯 10 mg/mL 組 3 1.01±0.04#▲△△安腸愈瘍湯25 mg/mL組 3 0.68±0.03#安腸愈瘍湯50 mg/mL組 3 0.28±0.04#

表4 不同濃度安腸愈瘍湯對HT-29細(xì)胞IL-8 mRNA表達(dá)的影響（±s）Tab.4 Expression of IL-8 mRNA levels by different concentrations of AYR in HT-29 cells（±s）

表4 不同濃度安腸愈瘍湯對HT-29細(xì)胞IL-8 mRNA表達(dá)的影響（±s）Tab.4 Expression of IL-8 mRNA levels by different concentrations of AYR in HT-29 cells（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；與安腸愈瘍湯0.1 mg/mL組比較，▲P＜0.01；與安腸愈瘍湯1 mg/mL組比較，△P＜0.01。

組別 n IL-8對照組 6 1.00±0.06模型組 6 10.55±0.79*安腸愈瘍湯0.1 mg/mL組 6 5.78±0.50#安腸愈瘍湯 1 mg/mL 組 6 2.65±0.32#▲安腸愈瘍湯 10 mg/mL 組 6 1.35±0.14#▲△

3.3 安腸愈瘍湯對LPS誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞IL-13、TFF3分泌水平的影響 與對照組比較，模型組IL-13、TFF3表達(dá)減少（P＜0.01）；與模型組相比，各用藥組 IL-13、TFF3分泌均增多（P＜0.05或 P＜0.01）；安腸愈瘍湯高濃度組IL-13、TFF3表達(dá)高于中、低濃度組（P＜0.01），安腸愈瘍湯高濃度組 IL-13、TFF3表達(dá)與5-AS組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見表5。

3.4 安腸愈瘍湯對LPS誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞IL-13、TFF3熒光強度的影響 以對照組熒光強度為100%，免疫熒光分析結(jié)果顯示：與對照組相比，模型組 IL-13、TFF3熒光強度降低（P＜0.01）；與模型組相比，各用藥組IL-13、TFF3熒光強度均增強（P＜0.05或P＜0.01）；安腸愈瘍湯高濃度組IL-13、TFF3熒光強度高于中、低濃度組（P＜0.01），安腸愈瘍湯高濃度組IL-13、TFF3熒光強度低于美沙拉秦組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表 6、圖 1、圖 2。

表5 安腸愈瘍湯對LPS誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞IL-13、TFF3分泌的影響（±s）Tab.5 IL-13，TFF3 secretion in HT-29 cells induced by LPS with AYR（±s） pg/mL

表5 安腸愈瘍湯對LPS誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞IL-13、TFF3分泌的影響（±s）Tab.5 IL-13，TFF3 secretion in HT-29 cells induced by LPS with AYR（±s） pg/mL

注：與對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與安腸愈瘍湯10 mg/mL組比較，▲P＜0.01。

組別 n對照組 3模型組 3安腸愈瘍湯0.1 mg/mL組 3安腸愈瘍湯1 mg/mL組 3安腸愈瘍湯10 mg/mL組 3 5-AS組 3 IL-13 TFF3 34.66±1.64 238.85±16.47 19.41±1.71* 179.86±6.87*21.65±1.15#▲ 198.61±7.76##▲26.45±1.14##▲ 227.61±9.98##▲33.53±2.64## 246.12±8.93##35.26±2.29## 253.37±6.15##

表6 安腸愈瘍湯對LPS誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞IL-13、TFF3熒光強度影響（±s）Tab.6 Fluorescent intensity of IL-13，TFF3 in HT-29 cells induced by LPS with AYR（±s） %

表6 安腸愈瘍湯對LPS誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞IL-13、TFF3熒光強度影響（±s）Tab.6 Fluorescent intensity of IL-13，TFF3 in HT-29 cells induced by LPS with AYR（±s） %

注：與對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與安腸愈瘍湯10 mg/mL組比較，▲P＜0.01。

組別 n對照組 3模型組 3安腸愈瘍湯0.1 mg/mL組 3安腸愈瘍湯1 mg/mL組 3安腸愈瘍湯10 mg/mL組 3 5-AS組 3 IL-13 TFF3 100.00±9.62 100.00±5.93 53.89±6.51* 70.82±0.88*68.06±4.68#▲ 82.56±7.35#▲82.41±4.86##▲ 91.53±3.81##▲104.99±7.23## 106.78±7.36##116.26±6.58## 116.18±8.18##

圖1 安腸愈瘍湯對LPS誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞IL-13熒光強度Fig.1 The fluorescent intensity of IL-13 in HT-29 cells induced by LPS with AYR

3.5 安腸愈瘍湯對LPS誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞IL-13、JAK1、STAT6、TFF3 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，模型組 IL-13、JAK1、STAT6、TFF3 mRNA和蛋白表達(dá)均下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組相比，各用藥組IL-13、JAK1、STAT6、TFF3 mRNA 和蛋白表達(dá)均上調(diào)（P＜0.05或 P＜0.01）；安腸愈瘍湯高濃度組 IL-13、JAK1、STAT6、TFF3 mRNA 和蛋白表達(dá)高于中、低濃度組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或 P＜0.01），高濃度組 IL-13、JAK1、STAT6、TFF3 mRNA 和蛋白表達(dá)與5-AS組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。中藥中、低濃度組 IL-13、JAK1、STAT6、TFF3 mRNA 和蛋白的表達(dá)低于5-AS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表7、表 8、圖 3。

圖2 安腸愈瘍湯對LPS誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞內(nèi)TFF3表達(dá)影響Fig.2 The fluorescent intensity of TFF3 in HT-29 cells induced by LPS with AYR

表7 各組mRNA表達(dá)（±s）Tab.7 Expression of mRNA levels in each group（±s）

表7 各組mRNA表達(dá)（±s）Tab.7 Expression of mRNA levels in each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；與安腸愈瘍湯 10 mg/mL 組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與 5-AS 組比較，△P＜0.01。

組別對照組模型組安腸愈瘍湯0.1 mg/mL組安腸愈瘍湯1 mg/mL組安腸愈瘍湯10 mg/mL組5-AS組n 3 3 3 3 3 3 IL-13 JAK1 STAT6 TFF3 1.00±0.03 1.00±0.07 1.00±0.07 1.00±0.05 0.22±0.06** 0.36±0.02** 0.21±0.13* 0.32±0.06*2.04±0.43#▲▲△ 1.73±0.06#▲▲△ 4.00±0.33#▲▲△ 1.77±0.09#▲▲△2.54±0.36#▲△ 2.47±0.22#▲▲△ 4.76±0.15#▲▲△ 2.35±0.25#▲▲△3.09±0.16# 3.36±0.12# 6.42±0.56# 3.30±0.28#3.31±0.40# 3.58±0.24# 6.95±0.74# 3.52±0.14#

4 討論

UC的治療目標(biāo)是在誘導(dǎo)及維持臨床癥狀緩解的基礎(chǔ)上強調(diào)黏膜愈合[16-17]，修復(fù)損傷的腸道黏膜屏障是UC治療的關(guān)鍵。安腸愈瘍湯是治療UC的經(jīng)驗方，臨床療效確切，前期臨床研究[4-5]發(fā)現(xiàn)其對UC患者內(nèi)鏡黏膜愈合及組織病理學(xué)炎癥的緩解均有著良好的療效。前期實驗研究[6-9]發(fā)現(xiàn)安腸愈瘍湯能上調(diào)血清中抗炎因子IL-13以及腸道黏膜修復(fù)因子TFF3、MUC2的表達(dá)，具有良好的抗炎及促進(jìn)黏膜修復(fù)的作用。但是對于安腸愈瘍湯調(diào)控TFF3分子的上游調(diào)控通路研究尚不明確，研究表明IL-13可通過STAT6途徑上調(diào)TFF3 mRNA及蛋白水平的表達(dá)[18]。蛋白酪氨酸激酶（JAK）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子（STAT）信號通路涉及實體腫瘤、淋巴瘤以及炎癥性疾病[19]等的發(fā)病機制，研究發(fā)現(xiàn)JAK1/STAT6通路在UC的發(fā)病中起著重要調(diào)控作用[8-11，20]。JAK1/STAT6主要由IL-4、IL-13激活[21]以啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄的功能。STAT6在Th2細(xì)胞的分化中有著重要的影響，影響B(tài)細(xì)胞抗原呈遞的細(xì)胞表面分子表達(dá)，調(diào)節(jié)IL-10等炎癥因子的表達(dá)[22]。有研究發(fā)現(xiàn)STAT6-/-的小鼠在三硝基苯磺酸（TNBS）誘導(dǎo)后出現(xiàn)了腸道黏膜傷口的愈合延遲，與對照組比較抗炎細(xì)胞因子IL-10顯著下降。還有研究發(fā)現(xiàn)通過調(diào)控JAK1/STAT6通路調(diào)節(jié)一氧化氮合成酶（iNOS）和干擾素-γ（IFN-γ）的生成發(fā)揮對腸黏膜炎癥的保護(hù)作用[23]。本研究在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步從體外實驗探討安腸愈瘍湯對JAK1/STAT6通路的影響。

表8 各組蛋白表達(dá)（±s）Tab.8 Protein expression in each group（±s）

表8 各組蛋白表達(dá)（±s）Tab.8 Protein expression in each group（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與安腸愈瘍湯 10 mg/mL 組比較，▲P＜0.01；與 5-AS 組比較，△P＜0.01。

組別 JAK1 STAT6 TFF3對照組 0.89±0.01 0.63±0.03 1.01±0.01模型組 0.75±0.03* 0.45±0.05* 0.83±0.02*安腸愈瘍湯 0.1 mg/mL 組 0.89±0.01##▲△ 0.59±0.04##▲△ 1.02±0.01##▲△安腸愈瘍湯 1 mg/mL 組 0.95±0.01##▲△ 0.70±0.03##▲△ 1.14±0.01##▲△安腸愈瘍湯 10 mg/mL 組 1.15±0.01## 1.12±0.04## 1.25±0.02##5-AS 組 1.17±0.02## 1.12±0.06## 1.24±0.05##n 3 3 3 3 3 3 IL-13 1.11±0.01 0.52±0.04*0.57±0.04#▲△0.70±0.03##▲△1.05±0.02##1.08±0.03##

圖3 各組蛋白的表達(dá)Fig.3 Protein expression in each group

既往研究[14-15]采用LPS干預(yù)HT-29細(xì)胞構(gòu)建體外炎癥模型，LPS刺激細(xì)胞后可導(dǎo)致大量炎癥因子如IL-1、IL-6、IL-8的釋放，而且還會進(jìn)一步生成并釋放炎癥因子如白三烯等[24]，是常用的構(gòu)建細(xì)胞炎癥模型的誘導(dǎo)因子。在既往基礎(chǔ)上課題組又進(jìn)行了炎癥模型的驗證，IL-8是重要的炎癥趨化因子，由LPS刺激HT-29細(xì)胞后激活TLR4/NF-κB通路產(chǎn)生[25]，IL-13是重要的抗炎因子，本研究中發(fā)現(xiàn)LPS干預(yù)HT-29細(xì)胞后出現(xiàn)致炎因子IL-8上升以及抗炎因子IL-13下降，提示模型構(gòu)建成功。國內(nèi)炎癥性腸病治療指南推薦5-AS作為輕中度UC的一線用藥，有良好的抗炎調(diào)節(jié)免疫作用，有研究表明5-AS可以通過抑制前列腺素的合成及白三烯的釋放從而起到抗炎作用，還能抑制炎癥因子的釋放減輕腸道黏膜炎癥反應(yīng)[26]，因此選擇5-AS作為陽性對照藥物。

本研究結(jié)果顯示，安腸愈瘍湯可能通過上調(diào)IL-13的分泌，激活JAK1/STAT6通路，促進(jìn)黏膜修復(fù)因子TFF3的分泌，減輕HT-29細(xì)胞炎癥模型的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮保護(hù)作用。安腸愈瘍湯具有劑量依賴性的作用特點，高濃度組作用優(yōu)于中、低濃度組，但與5-AS組比較未見明顯優(yōu)勢。本實驗初步探討了安腸愈瘍湯對LPS誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞炎癥模型可能的保護(hù)機制，顯示出安腸愈瘍湯對腸道黏膜良好的修復(fù)作用。今后將從UC大鼠模型體內(nèi)實驗進(jìn)一步探討安腸愈瘍湯對腸道黏膜屏障的保護(hù)機制。