中藥減肥降脂復(fù)方中黃酮提取方法的研究及含量測(cè)定

王婭玲　陶然　徐凱旋　李佳懌　王悅　宋興爽　王婕　高世杰

摘????? 要：按照藥典含量檢測(cè)的相關(guān)規(guī)定，檢測(cè)中藥減肥降脂方中黃酮的含量并考察比色法的可靠性。采用了超聲輔助乙醇回流法測(cè)定減肥降脂復(fù)方中黃酮的含量，所測(cè)曲線相關(guān)性良好，符合Lambert-Beer定律。減肥降脂復(fù)方中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45.065 3 mg·g^-1，精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.80%，重復(fù)性的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.50%，穩(wěn)定性的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.44%，平均加標(biāo)回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為102.20%，表明比色法檢測(cè)減肥降脂復(fù)方中的黃酮含量符合相關(guān)規(guī)定。

關(guān)? 鍵? 詞：中藥纖體;總黃酮;減肥降脂;含量測(cè)定;方法學(xué)研究

中圖分類號(hào)：TQ464?????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A?? ????文章編號(hào)： 1671-0460（2020）06-1114-04

Study on Determination of Flavonoids in Chinese Medicine Weight Loss and Lipid-lowering Compound

WANG Ya-ling， TAO Ran， XU Kai-xuan， LI Jia-yi， WANG Yue， SONG Xing-shuang， WANG Jie， GAO Shi-jie

（School of Pharmacy， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan Shandong 250014， China）

Abstract： According to the relevant regulations of pharmacopoeia content detection， the content of flavonoids in weight-reducing and lipid-lowering prescriptions of traditional Chinese medicine was detected and the reliability of colorimetry was investigated. Ultrasonic-assisted ethanol reflux method was used to determine the content of flavonoids in weight-reducing and lipid-lowering compound. The measured curves have good correlation and conform to Lambert-Beer law. The content of total flavonoids in weight-reducing and lipid-lowering compound is 45.065 3 mg·g^-1， the relative standard deviation of precision is 1.80%， the relative standard deviation of repeatability is 1.50%， the relative standard deviation of stability is 0.44%， and the relative standard deviation of average standard addition recovery rate is 102.20%， which indicates that the content of flavonoids in weight-reducing and lipid-lowering compound detected by colorimetry conforms to relevant regulations.

Key words： Traditional Chinese medicine slimming; Flavonoids; Weight loss and lipid-lowering; Content determination; Methodological study

近年來肥胖癥發(fā)病率不斷升高^[1]，導(dǎo)致慢性疾病年輕化^[2]，新陳代謝負(fù)擔(dān)增大^[3]，肥胖能增加癌癥和慢性疾病的發(fā)病率^[4]。近年中醫(yī)對(duì)肥胖病進(jìn)行深入研究，研究發(fā)現(xiàn)中藥藥效緩和、整體調(diào)節(jié)，不良反應(yīng)少，減肥效果較為理想，對(duì)開發(fā)新品減肥復(fù)方制劑具有重要意義。

減肥降脂復(fù)方以辯證論治為治療法則，抑胃扶脾，調(diào)和陰陽，利痰化濕。此方為山東中醫(yī)藥大學(xué)王集會(huì)教授總結(jié)出的經(jīng)驗(yàn)用方，具有調(diào)節(jié)代謝、減肥消脂的作用，其中黃酮類化合物能夠清除人體自由基，其明顯的降脂生理活性被普遍用于高血脂藥物中^[5]。目前，關(guān)于黃酮含量測(cè)定、結(jié)構(gòu)分析的研究很多，但對(duì)實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確性考察較少，結(jié)合黃酮的多種提取方法，黃酮在乙醇中的溶解度最大，提取最為充分，因此本實(shí)驗(yàn)采用超聲輔助乙醇回流的方法測(cè)定黃酮含量，并研究其測(cè)定方法的準(zhǔn)確性^[6]，以期為提取分離黃酮類有機(jī)物和研究新型減肥降脂制劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1? 實(shí)驗(yàn)

1.1? 藥品

藥品由山東中醫(yī)藥大學(xué)制備粉碎。

1.2? 試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品;氫氧化鈉（AR）， 六水氯化鋁（AR），亞硝酸鈉（AR），無水乙醇（AR）[7]。

1.3? 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

UV9100B型紫外-可見分光光度計(jì); 高速粉碎機(jī); 恒溫水浴鍋[8]; 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀; 遠(yuǎn)紅外輻射干燥箱 [9] ; PH計(jì); FA1004N電子天平。

2? 實(shí)驗(yàn)測(cè)定

2.1? 對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

精確稱定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20.00 mg，配制60%的乙醇超聲稀釋，上下振搖至均勻，移入容量瓶，蒸餾水定容，即為0.20 mg·mL^-1的待測(cè)品溶液，放于冰箱中以防變質(zhì)。

精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，用移液槍加入試管中，先加配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%乙醇溶液5 mL，再加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5% 的NaNO₂溶液300 μL，上下?lián)u晃至均勻，放置6 min^[10];然后小心倒入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的六水氯化鋁600 μL，上下?lián)u晃至均勻后，靜置5 min，最后加1.0 mol·L^-1的NaOH溶液2 mL^[11]，并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的乙醇稀釋至刻度。

2.2 ?回流制備待測(cè)品

準(zhǔn)確稱量1.000 0 g藥品， 加30 mL 80%乙醇溶液調(diào)至比例為1∶30， 調(diào)為40 ℃水浴超聲處理20 min， 通入冷水80 ℃回流2 h，離心，抽濾，向上清液加稀釋為30%濃度的乙醇至50 mL， 冷藏以防變質(zhì)。

2.3 ?樣品測(cè)定

用電子天平稱取1.0 g減肥降脂藥品，向其中加入30 mL乙醇溶液，置于圓底燒瓶80 ℃水浴加熱，降溫后抽濾，放置冰箱中冷藏以防變質(zhì)。每次吸取1 mL測(cè)定黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.4 ?實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性研究

2.4.1? 精密度

準(zhǔn)確稱取減肥方待測(cè)藥品5份1.000 0 g，調(diào)節(jié)為80 ℃通入蒸餾水回流2 h，根據(jù)“2.1”方法提取制備，在相同條件下重復(fù)制備待測(cè)液檢測(cè) ^[12]，根據(jù)吸光度，計(jì)算精密度。

2.4.2 ?穩(wěn)定性

準(zhǔn)確稱取減肥方待測(cè)藥品5份1.000 0 g，80 ℃水浴通入冷凝水回流2 h，在相同條件下連續(xù)提取測(cè)定5次，按照“2.1”方法提取制備，于510 nm波長下測(cè)定放置不同時(shí)間的吸光度，取平均值，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差R_SD%。

2.4.3? 重復(fù)性

準(zhǔn)確稱取減肥方樣品5份1.000 0 g，80 ℃水浴加熱乙醇回流2 h，根據(jù)“2.1”方法提取制備，重復(fù)提取測(cè)定5次，排除實(shí)驗(yàn)操作誤差的影響，檢測(cè)減肥降脂復(fù)方待測(cè)溶液的重復(fù)性。

2.4.4? 加標(biāo)回收率

準(zhǔn)確稱定5.000 0 mg的蘆丁對(duì)照品加入減肥方待測(cè)藥品中，準(zhǔn)備5組相同實(shí)驗(yàn)，80 ℃水浴加熱乙醇回流2 h，按照“2.1”提取制備，根據(jù)吸光度，計(jì)算加標(biāo)回收率R_SD%^[13]。

3? 結(jié)果與分析

3.1 ?回歸方程

根據(jù)圖1，減肥降脂復(fù)方中黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)與其制備溶液的質(zhì)量濃度具有一定量效關(guān)系，線性關(guān)系為y=? 0.502 9x+0.007 5，R²=0.998 3，說明減肥降脂復(fù)方中的黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.20～1.20 mg/g內(nèi)線性良好。

3.2? 精密度實(shí)驗(yàn)

連續(xù)5次檢測(cè)制備好的溶液的吸光度，減肥降脂復(fù)方中黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為43.56、45.71、43.52、44、43.92 mg·g^-1，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.80%（n=5），結(jié)果表明，該方法測(cè)定減肥降脂復(fù)方中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)精密度良好（表1）。

3.3? 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

連續(xù)5次檢測(cè)待測(cè)溶液的吸光度，總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為44.01、42.27、44.11、43.76、43.51 mg·g^-1，R_SD=1.50%（n=5），說明該方法測(cè)定減肥降脂復(fù)方溶液黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)放置一段時(shí)間后實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)仍有意義（表2）。

3.4? 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

在相同條件下提取制備減肥降脂復(fù)方的待測(cè)液，測(cè)定5次，吸光度分別為0.460 1、0.461 8、0.465 1、0.459 8、0.464 3，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差=0.46%（n=5），黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為45.00、45.17、45.50、44.97、45.42 mg·g^-1，結(jié)果說明該方法測(cè)定樣品中總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)方法較準(zhǔn)確，均在誤差范圍內(nèi)（表3）。

3.5? 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

根據(jù)表4，樣品的平均回收率為102.20 %，連續(xù)5次所測(cè)得吸光度分別為0.463 9、0.460 1、0.454 6、0.463 3、0.457 4，加入標(biāo)準(zhǔn)品后，黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為45.96、45.51、44.99、45.83、45.24 mg·g^-1，符合回收率的標(biāo)準(zhǔn)要求，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差為0.77%，符合R_SD≤5%的要求，說明回收率較高^[14]，滿足分析要求（表4）。