沖泡條件對(duì)玫瑰茄花青素及總黃酮溶出量的影響

黃曉辰，馬金魁，梁樂欣，馮潤(rùn)香

（肇慶學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，廣東肇慶526061）

玫瑰茄（Hibiscus sabdariffa L.），又名洛神花，是一種一年或多年生的錦葵科木槿屬植物，廣泛分布于熱帶及亞熱帶地區(qū)的國(guó)家，是一種傳統(tǒng)的藥食兩用植物，其莖、葉、花和種子皆可加以利用[1]。嫩葉或莖常用于制作沙拉、酸辣醬或配料[2-3]；種子含豐富的蛋白質(zhì)，可用于煮湯、榨油或發(fā)酵后用于調(diào)味[1]；花則被廣泛應(yīng)用于果凍、果醬、葡萄酒等各種食品及飲料的加工[4-6]。玫瑰茄花萼為杯狀肉質(zhì)結(jié)構(gòu)[7]，顏色為紫紅色，含豐富的碳水化合物、膳食纖維、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)和多種生物活性物質(zhì)，如有機(jī)酸、植物甾醇、多酚類化合物、花青素、多糖等[1，8]?，F(xiàn)代藥理研究表明，玫瑰茄花提取物具有降壓減脂[9-10]、抗菌消炎[11-12]、抗癌[13]、預(yù)防貧血[14]、治療鎘中毒[15]等生理作用。

黃酮類化合物廣泛存在于植物體中，是一類次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有很強(qiáng)的抗氧化作用，可降低心血管疾病的發(fā)病率、防癌消炎、調(diào)節(jié)免疫[16]。玫瑰茄花中含豐富的黃酮類化合物，包括花青素、黃酮、黃烷酮、黃酮醇、黃烷醇和異黃酮，其中花青素是玫瑰茄抗氧化作用的主因[1]?；ㄇ嗨厥且活愃苄蕴烊簧兀窃S多植物體的主要呈色物質(zhì)，因不同植物中的細(xì)胞液酸堿度不同，而呈現(xiàn)不同的顏色[17]。研究表明，玫瑰茄花中的花青素主要是飛燕草素-3-桑布雙糖苷、矢車菊素-3-桑布雙糖苷、飛燕草素葡萄糖苷和矢車菊素葡萄糖苷[1]。

隨著消費(fèi)者保健意識(shí)的覺醒和大健康時(shí)代的到來，花茶成為更多人群的健康選擇。玫瑰茄花茶因其獨(dú)特的風(fēng)味、色澤和天然的保健功能而備受青睞。我國(guó)對(duì)玫瑰茄的研究起步較晚，現(xiàn)階段，針對(duì)玫瑰茄花的研究主要集中于其活性組分提取及藥理作用的探索，而有關(guān)日常生活中玫瑰茄花茶的沖泡及其活性成分溶出的研究寥寥無幾。研究沖泡條件對(duì)玫瑰茄花青素和黃酮類化合物溶出的影響，將有助于玫瑰茄系列健康食品的研發(fā)，提高其資源利用率。本研究利用正交試驗(yàn)方法優(yōu)化玫瑰茄花茶的沖泡條件，以期為玫瑰茄花茶的合理沖泡和飲用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玫瑰茄干花萼，無蟲害且無腐爛霉變，產(chǎn)地云南。將玫瑰茄花萼置于45℃干燥過夜，于-18℃密封存儲(chǔ)，待用。

無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉：均為分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；氯化鉀、鹽酸、三水合乙酸鈉、九水合硝酸鋁：均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（LE70R58）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

V-1100D可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；BSA124S-CW電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；DHG-9145A電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HHS-21-6電熱恒溫水浴鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；TDL-60B低速臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

準(zhǔn)確稱取一定量的玫瑰茄干花萼樣品于燒杯中，在設(shè)定的沖泡時(shí)間、沖泡溫度、茶水比參數(shù)下，沖泡1次，過濾，待濾液冷卻至室溫（26℃）后，定容，即得玫瑰茄花茶茶湯樣品。

1.3.1 玫瑰茄沖泡條件的單因素試驗(yàn)

1.3.1.1 影響玫瑰茄花青素溶出量的單因素研究

稱取1 g玫瑰茄樣品，分別固定沖泡溫度70℃、茶水比1∶40（g/mL）、沖泡時(shí)間25 min的條件下，研究不同沖泡時(shí)間（20、25、30、35、40 min）、不同沖泡溫度（60、70、80、90、100℃）、不同茶水比[1 ∶20、1 ∶30、1∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL）]對(duì)玫瑰茄茶湯內(nèi)花青素溶出量的影響。

1.3.1.2 影響玫瑰茄總黃酮溶出量的單因素研究

稱取1 g玫瑰茄樣品，分別固定沖泡溫度70℃、茶水比1∶50（g/mL）、沖泡時(shí)間30 min的條件下，研究不同沖泡時(shí)間（20、25、30、35、40 min）、不同沖泡溫度（60、70、80、90、100℃）、不同茶水比[1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60、1 ∶70（g/mL）]對(duì)玫瑰茄茶湯內(nèi)總黃酮溶出量的影響。

1.3.2 玫瑰茄沖泡條件的正交試驗(yàn)

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以沖泡時(shí)間、沖泡溫度、茶水比為試驗(yàn)因素，進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)，研究沖泡時(shí)間、沖泡溫度、茶水比對(duì)玫瑰茄花茶茶湯內(nèi)花青素、總黃酮溶出量的影響?；ㄇ嗨厝艹龅恼辉囼?yàn)因素水平表見表1。

表1 花青素溶出的正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test regarding anthocyanins in roselle tea

總黃酮溶出的正交試驗(yàn)因素水平表見表2。

表2 總黃酮溶出的正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test regarding flavonoids in roselle tea

1.3.3 玫瑰茄茶湯中花青素溶出量的測(cè)定

參考Amaya-Cruz等[18]的方法，略作修改，依據(jù)pH示差法的原理測(cè)定玫瑰茄茶湯內(nèi)花青素的含量。稱取一定量的玫瑰茄樣品，用熱水沖泡一定時(shí)間后，過濾，移取2 mL濾液于10 mL容量瓶中，分別用pH 1.0、pH 4.5的緩沖溶液定容，在40℃水浴中反應(yīng)平衡50 min。以蒸餾水作空白對(duì)照，分別在520 nm和700 nm處測(cè)定花青素的吸光值，選用矢車菊-3-葡萄糖苷作為計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)，利用Fuleki公式對(duì)玫瑰茄茶湯中花青素的溶出量進(jìn)行計(jì)算。

式中：△A為花青素總吸光值；V為提取液總體積，mL；k為稀釋倍數(shù)；M為Cy-3-Glu（矢車菊-3-葡萄糖苷）的相對(duì)分子質(zhì)量，449.2 g/mol；ε為Cy-3-Glu的消光系數(shù)，26 900 L/（mol·cm）；m為樣品質(zhì)量，g；L為光程，數(shù)值為1 cm。

1.3.4 玫瑰茄茶湯中總黃酮溶出量的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：參照范金波等[19]的方法，略作修改。準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用80%乙醇溶解、定容至50 mL，得濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取 1、4、8、12、16 mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于 50 mL 容量瓶中，加入5%的亞硝酸鈉溶液1.4 mL，混勻靜置6 min；加入10%硝酸鋁溶液1.4 mL，混勻后靜置6 min；加入1 mol/L的氫氧化鈉溶液10 mL，用80%的乙醇定容至50 mL，搖勻，靜置10 min，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光值。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為y=11.346x-0.006 1（R2=0.999 4）。

玫瑰茄茶湯中總黃酮溶出量測(cè)定：取玫瑰茄茶湯5 mL于50 mL容量瓶中，按黃酮標(biāo)曲繪制方法測(cè)定樣品的吸光度，代入回歸方程，得待測(cè)茶湯中總黃酮的含量。按下式計(jì)算樣品茶湯內(nèi)總黃酮的溶出量：

式中：C為提取液濃度，mg/mL；N為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，mL；M為玫瑰茄質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 沖泡時(shí)間對(duì)花青素溶出量的影響

沖泡時(shí)間對(duì)花青素溶出量的影響見圖1。

圖1 沖泡時(shí)間對(duì)花青素溶出量的影響Fig.1 Effect of brewing time on the release of anthocyanidins

由圖1可知，在一定沖泡時(shí)間內(nèi)（20 min～40 min），玫瑰茄茶湯中花青素溶出量呈先增加后減小的趨勢(shì)。當(dāng)沖泡時(shí)間較短時(shí)，隨著沖泡時(shí)間的延長(zhǎng)，花青素溶出量增大；當(dāng)沖泡時(shí)間為25 min時(shí)，花青素的溶出量最大，達(dá)6.82 mg/g；之后，茶湯中花青素的含量又逐漸減少。沖泡時(shí)間過短，玫瑰茄花未被充分浸泡，花青素還未大量溶出；但沖泡時(shí)間過長(zhǎng)，花青素因受熱易降解，且其他雜質(zhì)組分的逐步溶出將導(dǎo)致茶湯中花青素含量降低[1，7]。

2.1.2 沖泡溫度對(duì)花青素溶出量的影響

沖泡溫度對(duì)花青素溶出量的影響見圖2。

圖2 沖泡溫度對(duì)花青素溶出量的影響Fig.2 Effect of brewing temperature on the release of anthocyanidins

由圖2可知，沖泡溫度對(duì)玫瑰茄茶湯中花青素溶出有顯著影響。隨著沖泡溫度升高，花青素溶出量呈先增加后降低的趨勢(shì)；其中，在70℃時(shí)花青素的溶出量最大，為6.88 mg/g。溫度較低時(shí)，分子的運(yùn)動(dòng)速度較慢，花青素溶出量較??；隨著溫度的升高，花青素的溶出速度增加，但當(dāng)沖泡溫度高于70℃時(shí)，花青素溶出量逐漸下降，因?yàn)榛ㄇ嗨卦跍囟容^高的條件下，結(jié)構(gòu)易被破壞，發(fā)生降解，溫度越高，降解速度越快[20-21]。

2.1.3 茶水比對(duì)花青素溶出量的影響

茶水比對(duì)花青素溶出量的影響見圖3。

由圖 3 可知，當(dāng)茶水比在 1∶20（g/mL）～1∶40（g/mL）時(shí)，花青素溶出量呈上升趨勢(shì)，茶水比為1∶40（g/mL）時(shí)，溶出量達(dá)到最大值6.90 mg/g。原因可能為水的用量增多有利于花青素的溶出。但茶水比小于1∶40（g/mL）時(shí)花青素溶出量下降，原因可能為液體比例過大會(huì)稀釋提取濃度，使花色苷含量降低[21]，且水量過大時(shí)，花色苷分子間作用力變小，其穩(wěn)定性下降容易分解[7，22]。

圖3 茶水比對(duì)花青素溶出量的影響Fig.3 Effect of tea-water ratio on the release of anthocyanidins

2.1.4 沖泡時(shí)間對(duì)總黃酮溶出量的影響

沖泡時(shí)間對(duì)總黃酮溶出量的影響見圖4。

圖4 沖泡時(shí)間對(duì)總黃酮溶出量的影響Fig.4 Effect of brewing time on the release of flavonoids

通過圖4可知，在20 min～35 min范圍內(nèi)，沖泡時(shí)間過短，黃酮類化合物溶出不徹底，隨著沖泡時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮溶出量逐漸增大；當(dāng)沖泡至35 min時(shí)，總黃酮溶出量最大為57.28 mg/g；沖泡時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，總黃酮溶出量減少，原因可能為黃酮類化合物在高溫條件下易發(fā)生氧化[23]，也可能是玫瑰茄細(xì)胞內(nèi)其他成分的溶出，干擾了黃酮類化合物的釋放[24]。

2.1.5 沖泡溫度對(duì)總黃酮溶出量的影響

沖泡溫度對(duì)總黃酮溶出量的影響見圖5。

圖5 沖泡溫度對(duì)總黃酮溶出量的影響Fig.5 Effect of brewing temperature on the release of flavonoids

通過圖5可知，隨著溫度不斷升高，玫瑰茄總黃酮溶出量增大，在70℃時(shí)總黃酮的溶出量達(dá)最大值57.22 mg/g。隨著溫度繼續(xù)升高，總黃酮溶出量反而呈下降趨勢(shì)。其原因可能是溫度的升高促進(jìn)了黃酮類物質(zhì)的溶出，但水溫過熱影響其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，一些熱敏性的黃酮類組分逐漸分解[25]；此外，水溫過高時(shí)使其他非黃酮類雜質(zhì)溶出，導(dǎo)致黃酮溶出量降低。

2.1.6 茶水比對(duì)總黃酮溶出量的影響

茶水比對(duì)總黃酮溶出量的影響見圖6。

圖6 茶水比對(duì)總黃酮溶出量的影響Fig.6 Effect of tea-water ratio on the release of flavonoids

通過圖 6 可知，當(dāng)茶水比在 1∶30（g/mL）～1∶50（g/mL）間時(shí)，玫瑰茄茶湯中總黃酮溶出量隨茶水比的降低逐漸增大；當(dāng)茶水比為1∶50（g/mL）時(shí)，總黃酮溶出量最大為 56.84 mg/g；當(dāng)茶水比低于 1∶50（g/mL），總黃酮溶出量逐步降低。其原因可能為，當(dāng)用水量較少時(shí)，玫瑰茄中的黃酮類化合物不能完全溶出；用水量太多，可能導(dǎo)致玫瑰茄中其他雜質(zhì)的溶出，影響黃酮的溶出量[26]，且因水的稀釋作用，造成茶湯中總黃酮含量的下降。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

玫瑰茄花青素的正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 玫瑰茄花青素的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of orthogonal experiment regarding anthocyanidins from roselle calyces

由表3的數(shù)據(jù)結(jié)果可知，各因素對(duì)玫瑰茄茶湯中花青素溶出量影響的先后順序?yàn)椋篊＞B＞A，即茶水比＞沖泡溫度＞沖泡時(shí)間。確定的最優(yōu)組合為A3B2C3，即沖泡時(shí)間30 min，沖泡溫度70℃，茶水比1∶50（g/mL）。

因?yàn)檎槐碇袥]有上述最優(yōu)條件的組合，為進(jìn)一步考察試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，在該最優(yōu)沖泡條件下，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得玫瑰茄茶湯中花青素的溶出量為7.94mg/g，高于正交試驗(yàn)中的最高溶出量7.82 mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.81%，表明該沖泡條件重復(fù)性好，可為玫瑰茄花茶沖泡中花青素的有效釋放提供理論依據(jù)。

玫瑰茄總黃酮的最佳沖泡工藝優(yōu)化的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。

表4 玫瑰茄總黃酮的最佳沖泡工藝優(yōu)化的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 The results of orthogonal experiment regarding flavonoids from roselle calyces

由表4結(jié)果可知，各因素對(duì)玫瑰茄茶湯中總黃酮溶出量影響的先后順序?yàn)椋篎＞G＞E，即沖泡溫度＞茶水比＞沖泡時(shí)間。最優(yōu)沖泡條件組合為E3F3G2，即沖泡時(shí)間40 min，沖泡溫度80℃，茶水比1∶50（g/mL）。該最優(yōu)組合恰好在正交試驗(yàn)表中，且所得總黃酮溶出率值最大為58.77 mg/g。

綜合以上正交試驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，玫瑰茄花茶中花青素和總黃酮沖泡的最佳條件參數(shù)不盡相同。在茶水比均為1∶50（g/mL）的條件下，花青素有效溶出的最適條件為70℃沖泡30 min，而總黃酮有效溶出的最適條件為80℃沖泡40 min?；ㄇ嗨厥敲倒迩阎悬S酮類化合物最重要的一大類，除此之外，還包含其他的黃酮類成分，如棉子皮亭、玫瑰茄紅及其各自的配糖體、原兒茶酸、丁香酚，以及甾醇類的β-谷固醇、麥角固醇等。在沖泡玫瑰茄花茶時(shí)，除花青素外，其它具有水溶性的黃酮類化合物也會(huì)隨同溶出。因此，在沖泡時(shí)，針對(duì)花青素和總黃酮有效溶出的沖泡條件不完全相同。

3 結(jié)論

本研究以玫瑰茄花茶茶湯中花青素及總黃酮的溶出量為指標(biāo)，利用單因素試驗(yàn)確定沖泡時(shí)間、沖泡溫度和茶水比對(duì)花青素及總黃酮溶出量的影響規(guī)律，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過正交試驗(yàn)確定花青素及總黃酮有效溶出的最佳沖泡條件。為使花青素有效溶出，玫瑰茄花茶的最佳沖泡方式為：沖泡時(shí)間30 min，沖泡溫度70℃，茶水比1∶50（g/mL），花青素溶出量可達(dá)7.94 mg/g。為使總黃酮有效溶出，玫瑰茄花茶的最佳沖泡方式為：沖泡時(shí)間40 min，沖泡溫度80℃，茶水比1∶50（g/mL），總黃酮溶出量為 58.77 mg/g。本試驗(yàn)優(yōu)化所得的花青素和總黃酮的最佳沖泡條件不盡相同，消費(fèi)者可依據(jù)自身的喜好和需求選擇合適的沖泡條件。