不同濃度憂遁草提取物抑制阪崎腸桿菌生長模型的研究

姚昱錕 林其洋 方婷

摘 要：人類感染阪崎腸桿菌（Cronobacter sakazakii）會引起一系列疾病，而憂遁草（Clinacanthus nutans CN）是一種具有消炎抑菌作用的天然藥用植物。為了量化評估憂遁草對阪崎腸桿菌的抑制作用，以阪崎腸桿菌為研究對象，探究在阪崎腸桿菌最適生長溫度37℃下，不同濃度的憂遁草提取物（25、50、75、100mg/mL）對在BHI中生長的阪崎腸桿菌的影響。結果表明，添加濃度為10%的體系中，憂遁草對延長阪崎腸桿菌的延滯期最長時常為4.116h，阪崎腸桿菌生長速率為1.094，而空白對照組分別為1.253h、1.726。可見，憂遁草對阪崎腸桿菌具有較好的抑制作用，且濃度越高，抑制效果越好。

關鍵詞：憂遁草;阪崎腸桿菌;生長模型

中圖分類號 R285文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2020）15-0028-06

Abstract： Cronobacter sakazakii can cause a series of diseases，and Clinacanthus nutans is a natural medicinal plant with anti-inflammatory and antibacterial effects.In order to quantify and evaluate the inhibitory effect of Cronobacter sakazakii on Clinacanthus nutans， this paper took Cronobacter sakazakii as the research object to explore different concentrations （25，50，75，100mg/mL） of Clinacanthus nutans extract at the optimal growth temperature of 37℃ on Cronobacter sakazakii grown in BHI.The results showed that the longest lag period of Clinacanthus nutans for prolonging Cronobacter sakazakii was 4.116 h in a system with a concentration of 10%，and the growth rate of Cronobacter sakazakii was 1.094， while the data of blank control group were 1.253h and 1.726， respectively.The results illustrated that Clinacanthus nutans had an excellent inhibitory effect on Cronobacter sakazakii， and the higher the concentration， the better the inhibitory effect.

Key words： Clinacanthus nutans; Cronobacter sakazakii; Growth model

阪崎腸桿菌（Cronobacter sakazakii）屬于腸桿菌科腸桿菌屬，兼性厭氧革蘭氏陰性菌，主要寄生于人和動物的腸道內，導致諸如新生兒腦膜炎、菌血癥、壞死性結腸炎[1-2]等一系列疾病。目前，乳飲料[3]、奶酪[4]和純牛奶[5]是阪崎腸桿菌的主要檢出對象，雖然醫(yī)學上可以通過抗生素治療相關疾病，但抗生素的頻繁使用會導致該菌對抗生素耐藥性的提高以及其他不良反應和副作用[6]。近年來，對阪崎腸桿菌的研究主要包括耐熱性[7]、耐酸堿性[8]以及水分活度、pH、培養(yǎng)基成分等因素的影響。鑒于阪崎腸桿菌的危害，找到對其有抑制作用的植物天然化學物質具有重大意義。

憂遁草（Clinacanthus nutans）為爵床科（Acanthaceae）鱷嘴花屬植物，別名鱷嘴花、扭序花、青箭、沙巴蛇草、柔刺草、小接骨等[9]，廣泛分布于馬來西亞、泰國、越南、印度尼西亞以及我國南部至西南部等熱帶地區(qū)[10]，是一種比較著名且廣泛使用的藥用植物。當前，世界各地對憂遁草的研究主要集中于憂遁草的抗病毒、抑制炎癥、抗癌、抗氧化以及成分等方面。國內有研究表明，產自揭陽的憂遁草提取物的抗氧化能力優(yōu)于產自海南的憂遁草提取物[11]。

為了探知微生物的生長狀態(tài)與外界環(huán)境變化之間的關聯(lián)，建立一定的數(shù)據(jù)模型對微生物的生長情況進行比較，是目前比較流行的微生物數(shù)據(jù)處理模式。目前，大部分的微生物試驗都與病原菌相關，因此，采用合適的微生物預測模型，有利于試驗結果的評估[12]。

本研究開展了不同濃度的憂遁草提取物對阪崎腸桿菌的抑制作用試驗，通過軟件IPMP2013建立阪崎腸桿菌在不同條件下動力學模型，使用模型評價憂遁草對阪崎腸桿菌抑制作用的量效關系。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 原料與菌種 揭陽憂遁草，購于揭陽許氏憂遁草種植基地。阪崎腸桿菌（ATCC 21544），購于中國檢驗檢疫科學研究院食品安全研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑 詳見表1。

1.1.3 主要試劑的配置方法 腦-心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基（BHI）：按說明書指示稱取BHI37g溶于1L的蒸餾水或去離子水中，使用微波爐加熱煮沸并攪拌至完全溶解，在高壓滅菌鍋中于121℃滅菌15min;結晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（VRBGA）培養(yǎng)基：按說明書指示稱取VRBGA51.5g溶解于1L的蒸餾水中，使用微波爐煮沸但沸騰時間不需要超過2min，待冷卻至50℃左右倒平板;1‰蛋白胨水（PW）：稱取1g的蛋白胨溶于1L的蒸餾水中，分別以9mL和9.9mL分裝于試管中，于高壓滅菌鍋中121℃滅菌15min備用;25mg/mL憂遁草提取液：稱取0.375g的憂遁草提取物溶解于腦-心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基（BHI），補足至15mL;50mg/mL憂遁草提取液：稱取0.75g的憂遁草提取物溶解于腦-心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基（BHI），補足至15mL;75mg/mL憂遁草提取液：稱取1.125g的憂遁草提取物溶解于腦-心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基（BHI），補足至15mL;100mg/mL憂遁草提取液：稱取1.5g的憂遁草提取物溶解于腦-心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基（BHI），補足至15mL。

1.1.4 儀器與設備 詳見表2。

1.2 試驗方法

1.2.1 阪崎腸桿菌培養(yǎng) 裝有阪崎腸桿菌凍干粉的塑料瓶→75%酒精棉消毒→封口處用酒精燈火焰燒熱→立即滴無菌水于塑料瓶封口處→旋開塑料瓶蓋子→加入1mL的BHI腦-心浸萃液態(tài)培養(yǎng)→溶解阪崎腸桿菌凍干粉→吸出并轉移至盛有10mL滅菌過的BHI培養(yǎng)管中→37℃靜置培養(yǎng)24h→吸取0.1mL菌懸液移至盛有10mLBHI的試管中，37℃恒溫培養(yǎng)箱振蕩培養(yǎng)24h→吸取0.1mL菌懸液加入到盛有10mLBHI的試管中，37℃恒溫培養(yǎng)箱振蕩培養(yǎng)24h→得到菌懸液[13-14]。

1.2.2 菌種保藏 將0.5mL菌懸液加入1.5mL的無菌塑料管→加入0.5mL純甘油→蓋緊管蓋置于-80℃冰箱中保藏。用無菌接菌環(huán)挑取一環(huán)菌懸液置于VRBGA平板培養(yǎng)基的表面劃線培養(yǎng)，將其置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，其后將平板置于4℃的冰箱中保存，該方法可以使菌體保持活力約1個月。

1.2.3 菌懸液制備 在進行實驗前12h，使用無菌接菌環(huán)挑取結晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上的1株阪崎腸桿菌轉移至裝有10mL腦-心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基的無菌離心管中，置于37℃的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)12h，130轉，使阪崎腸桿菌恢復生長，之后菌懸液經(jīng)過離心機離心（2500r，15min），在無菌條件下倒去上清液，加入10mL的蛋白胨水，充分溶解后再將其離心10min，再用10mL的蛋白胨水溶解沉淀，將菌懸液在裝有蛋白胨水的試管中進行梯度稀釋，稀釋成約為102～103CFU/mL的菌懸液。

1.2.4 不同濃度憂遁草對阪崎腸桿菌生長的影響試驗 在無菌操作臺中往50mL離心管中分別加入（0.375g、0.75g、1.125g和1.5g）不同品種的憂遁草提取物，然后加入BHI培養(yǎng)基，補足至15mL，以不添加憂遁草提取液腦-心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基組作為對照，37℃下培養(yǎng)24h（每個樣品做兩個平行），在不同的時間點取出菌液，用1‰的無菌蛋白胨水稀釋至合適的梯度，然后使用涂平板計數(shù)法計算菌落數(shù)。

1.2.5 曲線擬合與模型的建立 應用美國農業(yè)部東部研究中心開發(fā)的IPMP 2013軟件對試驗所得數(shù)據(jù)進行分析并建立模型。用Huang模型、Baranyi模型和Gompertz型，擬合含有不同濃度的憂遁草提取物的BHI中阪崎腸桿菌的生長數(shù)據(jù)，建立不同條件下阪崎腸桿菌生長的一級動力學模型。通過比較幾種模型的擬合參數(shù)，確定不同條件下阪崎腸桿菌在含有不同濃度的憂遁草提取液的BHI中生長的最佳模型。

2 結果與分析

2.1 37℃下BHI中阪崎腸桿菌生長曲線 由圖1可知，阪崎腸桿菌的接入量為102～103CFU/mL，在生長曲線的實驗中，這是合適的接入濃度。擬合模型的參數(shù)AIC和RMSE越小，則代表該數(shù)據(jù)模型的擬合效果越好。Y0代表初始接菌量，Lag代表延滯期，Ymax則代表穩(wěn)定期時的菌落數(shù)量，μmax則代表是最大比生長速率，結合各項參數(shù)得知，Huang模型為該條件下的最佳擬合模型（見表3）。

2.2 不同濃度揭陽憂遁草提取物BHI中的阪崎腸桿菌生長曲線

2.2.1 37℃下揭陽憂遁草提取物濃度為2.5%BHI中阪崎腸桿菌的生長曲線 從擬合曲線和擬合參數(shù)可以看出，Huang模型和Baranyi模型擬合效果優(yōu)于Gompertz模型，Huang模型的各項參數(shù)略低于Baranyi模型的擬合參數(shù)，結合擬合模型效果可以得知，Huang模型更適合擬合37℃下揭陽憂遁草提取物添加濃度為2.5%的BHI中阪崎腸桿菌的一級模型（見圖2、表4）。該試驗組的最大比生長速率為1.501，延滯期為1.886。

2.2.2 37℃下揭陽憂遁草提取物濃度為5%BHI中阪崎腸桿菌的生長曲線 從擬合曲線可以看出，Huang模型和Baranyi模型擬合效果優(yōu)于Gompertz 模型，Huang模型的AIC和RMSE均低于Baranyi模型，結合擬合模型其他參數(shù)，可以得知，Huang模型更適合擬合37℃下揭陽憂遁草提取物濃度為5%的BHI中阪崎腸桿菌的一級模型（見圖3、表5）。該實驗組的最大比生長速率為1.385，延滯期為2.236h。

2.2.3 37℃下揭陽憂遁草提取物濃度為7.5%BHI中阪崎腸桿菌的生長曲線 從擬合曲線可以看出，Huang模型和Baranyi模型的擬合效果較好，Huang模型的AIC和RMSE均低于Baranyi模型，結合擬合模型其他參數(shù)，可以得知Huang模型更適合擬合該條件下BHI中阪崎腸桿菌的一級模型（見圖4、表6）。實驗組的最大比生長速率為1.224，延滯期為3.4h。

2.2.4 37℃下揭陽憂遁草提取物濃度為10%BHI中阪崎腸桿菌的生長曲線 從擬合曲線可以看出，Huang模型和Baranyi模型擬合效果較好，Huang模型的AIC和RMSE略低于Baranyi模型，結合擬合模型其他參數(shù)，可以得知Huang模型更適合擬合該條件下BHI中阪崎腸桿菌的一級模型（見圖5、表7）。實驗組的最大比生長速率為1.094，延滯期為4.116h。

2.3 不同濃度憂遁草對阪崎腸桿菌抑制作用的影響 使用軟件IPMP 2013的不同擬合模型分別對含有不同濃度憂遁草提取物的BHI中阪崎腸桿菌的生長情況進行擬合，并根據(jù)AIC值與RMSE值2個參數(shù)以及模型的擬合程度選擇最適模型，AIC值與RMSE值越小，表明該種模型擬合效果最佳，則應選取該模型下的參數(shù)描述阪崎腸桿菌的生長狀況。由表4、表5、表6及表7可知，在所有的擬合結果中，Huang模型和Baranyi模型的擬合結果較好，Gompertz模型擬合結果較差，Huang模型的擬合參數(shù)均略小于Baranyi模型，所以選取Huang模型的擬合參數(shù)延滯期與最大比生長速率作為評價指標進一步的評價憂遁草提取物對阪崎腸桿菌的抑制作用，由于在10h時BHI中的阪崎腸桿菌已經(jīng)進入穩(wěn)定期，而添加憂遁草提取物的BHI中阪崎腸桿菌沒有進入穩(wěn)定期，因此選取該時間點下BHI中崎腸桿菌菌落數(shù)作為一個評價指標。

2.3.1 延滯期 從圖6可以看出，阪崎腸桿菌的延滯期在揭陽憂遁草提取物的作用下相比于對照組顯著延長，并且與憂遁草提取物的添加劑量呈正相關的關系。在添加了揭陽憂遁草提取物的試驗組中，延滯期從長到短為：4.116、3.4、2.236和1.886h，對應的體系中提取物的濃度為10%、7.5%、5%、2.5%。在空白對照中，阪崎腸桿菌的延滯期僅為1.253h，表明產自揭陽的憂遁草提取物具有延長阪崎腸桿菌延滯期的作用。

2.3.2 最大比生長速率 如圖7所示，憂遁草在任何濃度下都能夠降低阪崎腸桿菌的生長速率，其最大比生長速率的大小與培養(yǎng)液中的憂遁草提取物濃度呈反比。添加憂遁草提取物試驗組的最大比生長速率從大到小的順序為1.501、1.385、1.224、1.094?？瞻讓φ战M中阪崎腸桿菌的最大比生長速率為1.728。對比可以得出，憂遁草提取物對阪崎腸桿菌具有抑制效果，能降低體系中阪崎腸桿菌的最大比生長速率。

2.3.3 10h時體系中的菌落總數(shù) 當微生物進入穩(wěn)定期后，體系中微生物的數(shù)量將不再增長。在10h時，空白對照組中的阪崎腸桿菌已經(jīng)進入了穩(wěn)定期，但添加了不同濃度憂遁草試驗組中的阪崎腸桿菌卻尚未進入穩(wěn)定期。由圖8可知，不同濃度的憂遁草提取物對阪崎腸桿菌的抑制效果不同，抑制效果與濃度呈正相關。結果表明，揭陽憂遁草可以延長阪崎腸桿菌的延滯期，也可以降低阪崎腸桿菌的最大比生長速率，效果與憂遁草提取物濃度成正比。這可能是由于憂遁草濃度越高，憂遁草中的植物化學物質含量越高，導致其對阪崎腸桿菌的抑制效果越好。將阪崎腸桿菌培養(yǎng)10h后，BHI中的阪崎腸桿菌已進入穩(wěn)定期，但添加憂遁草提取物的試驗組中尚未進入，雖然兩者之間差異并不顯著，但均能夠有效地降低體系中的菌落數(shù)量。

3 結論

由本研究結果可知：（1）在試驗濃度梯度下，揭陽憂遁草對延長阪崎腸桿菌的延滯期最長時常為4.116h，對應的體系中提取物的濃度為10%，對照組則為1.253h。（2）揭陽憂遁草能有效降低阪崎腸桿菌的最大比生長速率，在添加濃度為10%的體系中，阪崎腸桿菌的生長速率為1.094，空白組的最大比生長速率則為1.726。

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（責編：張宏民）