香椿組織培養(yǎng)外植體的選擇和消毒

袁應(yīng)菊

摘 要：以太和香椿優(yōu)良母株為材料，研究太和香椿在進行組織培養(yǎng)時，不同外植體取材部位、不同消毒方法對其離體組織培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明：在進行香椿的離體培養(yǎng)時，幼嫩莖段是優(yōu)良部位;采用70%～75%的酒精浸泡30～40s后，再用0.1%的HgCl2消毒8分鐘，對外植體的消毒效果最好。

關(guān)鍵詞：香椿;組織培養(yǎng);外植體;消毒方法

中圖分類號 S644.4 文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2020）15-0019-03

Abstract： Taking the excellent mother plant of Taihe Toona as the material，to study the effects of different explants and different disinfection methods on tissue culture of Taihe Toona.The results showed that the young and tender stem was the best part in vitro culture of Toona sinensis. After 30～40s soaking in 70%～75% alcohol， the explants were sterilized with 0.1% HgCl2 for 8 minutes， and the effect of explants disinfection was the best.

Key words： Toona sinensis; Tissue culture; Explant; Disinfection method

香椿（Toona.sinensis Roem）楝科、香椿屬植物，為中國原產(chǎn)樹種，又被稱作紅香椿、香椿頭、椿甜樹等，是1種多年生落葉喬木[1]。因其香椿頭含有多種營養(yǎng)物質(zhì)，且口感香鮮脆嫩、食用方便，一直深受廣大消費者的喜愛。安徽省太和縣香椿的栽培歷史悠久，栽培品種多，有著“貢椿之鄉(xiāng)”的美稱。2014—2016年對當?shù)叵愦贿M行了良種選育工作，在進行良種無性繁育的過程中發(fā)現(xiàn)，為了保持其母本特性，現(xiàn)在普遍采用根蘗、扦插等無性繁殖方法，此種方法育苗數(shù)量有限，苗木生長良莠不齊，擴繁速度慢，育苗效率低，在有限資源條件下會嚴重影響出苗量和育苗的質(zhì)量。通過組織培養(yǎng)的方式進行香椿擴繁，育苗時不受時間和季節(jié)的限制，可在快速獲得無菌苗木的同時保持母本的優(yōu)良性狀，大大提高繁殖系數(shù)和育苗效率。本試驗對香椿離體培養(yǎng)時外植體的取材部位及消毒方法進行了研究，以期找出適宜的消毒方法，為香椿良種的組培快繁提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料 試驗選取太和香椿優(yōu)良母株的頂芽、幼嫩莖段、中部莖段、嫩葉，來源于安徽省太和縣大新鎮(zhèn)董廟村，安徽泰和香椿產(chǎn)業(yè)園有限公司香椿示范園內(nèi)。取材時間3月中旬至5月上旬，選擇健康、長勢良好的母株采集帶頂芽、幼嫩莖段、中部莖段、嫩葉的上部枝條，放入保鮮盒中帶回實驗室，備用。

1.2 試驗方法 試驗材料按以下程序進行處理：流水下沖洗，洗去表面雜物—用洗潔精浸泡，同時攪動5～10min—自來水沖洗50～60min—在無菌條件下用70%～75%酒精表面消毒30～40s—用無菌水清洗5～6次—用配制好的消毒液消毒—用無菌水反復(fù)清洗5～6次—放入無菌容器中備用，消毒后切去植物體材料與藥液接觸的傷口部分，再分切接種于準備好的無菌培養(yǎng)基上[2-3]。

基本培養(yǎng)基為經(jīng)過試驗改良的MS培養(yǎng)基，6-芐氨基嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）、1400強度瓊脂粉6.0g和蔗糖30g，pH5.8～6.2，即改良的Ms+6BA（0.3～0.8）+NAA（0.1～0.2）的培養(yǎng)基，培養(yǎng)室溫度（25±2）℃，空氣相對濕度60%～70%，光照時間為前7d每天10h，之后每天14h，光照度強度2000～2500lux[4]。統(tǒng)計3～20d內(nèi)不同培養(yǎng)外植體的污染率、存活率、枯死率等。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方法對香椿外植體消毒效果的影響 采用不同的消毒方法，會使香椿外植體在消毒時達到不同的消毒效果，為了找到相對有效的消毒方法，增加無菌苗的獲得數(shù)量，用不同種類、不同濃度的消毒劑對香椿進行外植體消毒處理。將香椿的幼嫩莖段作為外植體，采用HgCl2、次氯酸鈉、84消毒液4種不同的方式進行消毒，然后將處理好的外植體接種于改良Ms+6BA（0.3～0.8）+NAA（0.1～0.2）的培養(yǎng)基上，每瓶接種1個點，1個月后統(tǒng)計獲得的無菌外植體個數(shù)，結(jié)果如表1所示。由表1可見，采用0.1%的HgCl2消毒得到的香椿外植體的污染率最低為13%，按污染率從低到高的順序依次為0.1%的HgCl2<10%次氯酸鈉<6%次氯酸鈉<（8～10）%84消毒液。

2.2 消毒時間對外植體的影響 外植體在0.1%的HgCl2消毒劑中消毒的時間分別為4、6、8、12、14min，標注為1、2、3、4、5 5個處理，結(jié)果見圖1。由圖1可知，在進行外植體消毒處理時，污染率會隨著消毒時間的延長而下降，在6～8min之間，外植體的污染率成急劇下降，等到處理8min時會達到峰值，之后趨于緩和。采用0.1%的HgCl2進行消毒時，在消毒8min時香椿的外植體存活率達到峰值80%，此時污染率和枯死率都較低，之后呈現(xiàn)下降趨勢。說明消毒時間達到8min可以殺死絕大多數(shù)污染病菌，但是，隨著消毒時間的延長，枯死率表現(xiàn)呈直線上升，從而導(dǎo)致存活率下降。原因可能是在滅菌時，外植體受到汞離子的毒害而死亡。因此，外植體消毒時在考慮降低污染率的同時也要控制好消毒時間。

2.3 不同外植體對污染率的影響 先將香椿外植體不同部位進行預(yù)處理，接著在0.1 %的HgCl2消毒劑中消毒8min，后用無菌水沖洗，再把各部位（頂芽、幼嫩莖段、中部莖段、嫩葉）分別接入改良Ms+6BA（0.3～0.8）+NAA（0.1～0.2）的培養(yǎng)基中，觀察污染，枯死和存活情況，結(jié)果見表2。從表2可以看出，外植體頂芽的存活率最高，其次為幼嫩莖段、嫩葉，中部莖段最差，存活率為66%。

2.4 不同外植體部位對不定芽誘導(dǎo)的影響 根據(jù)表3，在進行香椿組培時，誘導(dǎo)不定芽能力最強的部位是頂芽和幼嫩莖段，其次是中部莖段;誘導(dǎo)愈傷組織能力最強的是嫩葉，但葉片誘導(dǎo)的愈傷組織沒有誘導(dǎo)出不定芽。

3 結(jié)論與討論

外植體帶菌情況會直接影響到組培效果的好壞，是否能夠有效獲得無菌材料是木本植物組織培養(yǎng)中的困難之一[3]。因此，在進行植物組織培養(yǎng)時，選取的外植體材料接種前必須消毒，讓材料完全不帶菌，這是決定接種成功的關(guān)鍵因素。研究表明，香椿組培時選擇幼嫩莖段作為外植體，在無菌條件下，采用70%～75%酒精浸泡30～40s，然后用0.1%的HgCl2消毒，效果最好，獲得的無菌苗數(shù)量也最多。因為70%～75%酒精具有雙重作用，既可以浸潤，又具有較強的殺菌作用，但卻不能徹底滅菌，需要配合其他消毒劑使用。0.1%的HgCl2中的Hg2+因為其能夠與帶負電荷的蛋白質(zhì)相互結(jié)合，從而使細菌蛋白發(fā)生變性、酶失活而有較好的滅菌作用。在處理外植體時，采用不同的消毒時間進行消毒，效果有明顯的差異。同種消毒劑使用時，隨著消毒時間的延長，污染率降低，枯死率會升高。本試驗的結(jié)果表明，0.1%的HgCl2處理最佳時間為8min。自然條件下的頂芽、幼嫩莖段、中部莖段和嫩葉均可作為外植體，但以幼嫩莖段為最好，其主要原因是幼嫩莖段帶菌量少，且生長速度快，易于再分化;頂芽生長也快，但是香椿頂芽葉片較多，不利于消毒;其它部位外植體比較老，細胞的再分化程度低。除此之外植物激素的分布梯度不同也會影響組培效果[5-6]，當植物體內(nèi)的某些激素以一定狀態(tài)的相對濃度存在時，植物體內(nèi)源激素分布就不均勻，最終導(dǎo)致基因表達的不一致，因此在香椿組培外植體選擇實驗中幼嫩莖段是最好的外植體。

參考文獻

[1]梁明勤，郭群鵬，陳世昌，等.菜用香椿組培快繁技術(shù)研究[J].園藝與種苗，2016（03）：58-61.

[2]馮金玲，陳輝，楊志堅，等.錐栗組織培養(yǎng)外植體消毒和選擇[J].福建林學院學報，2006（01）：22-25.

[3]吉訓(xùn)志，秦曉威，胡麗松，等.木本植物組織培養(yǎng)[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學，2019，39（04）：33-40.

[4]馮金玲，陳輝，陳世品，等.錐栗成熟胚離體培養(yǎng)初報[J].經(jīng)濟林研究，2004（03）：29-31.

[5]常莉，薛建平.生長素極性運輸研究進展[J].生物學雜志，2008，25（06）：9-13.

[6]高鷃銘，肖祥希，王志潔，等.香椿組培增殖和生根培養(yǎng)基篩選[J].福建林業(yè)科技，2018，45（02）：64-67+90.

（責編：王慧晴）