孕婦血漿中游離胎兒DNA水平檢測中表觀遺傳學(xué)方法的運(yùn)用評價

董芳娟 郝宇卉 趙瑞麗

【摘?要】?目的：評價孕婦血漿中游離胎兒DNA水平檢測中表觀遺傳學(xué)方法的運(yùn)用價值。方法：采用回顧性方法分析，選取60例孕婦作為研究對象，根據(jù)孕期分為早期、中期及晚期，每組20例。同時選取20例非妊娠婦女為對照組，檢測母體血漿中的游離DNA，比較各組Ct值。結(jié)果：對照組血漿中未檢測到u-maspin，特異性為100.0%。其他三組孕婦血漿中均有u-maspin基因，敏感性高達(dá)95.0%。不同妊娠期孕婦的m-maspin基因表達(dá)水平無顯著差異（P>0.05）。晚期妊娠組孕婦的△Ct、△△Ct均低于早期妊娠組、中期妊娠組，有顯著差異（P<0.05）。晚期妊娠組孕婦的2-△△Ct與對照組相比，有顯著差異（P<0.05）。結(jié)論：u-maspin基因可作為孕婦血漿中游離胎兒NDA水平變化的表觀遺傳學(xué)標(biāo)志，可擴(kuò)大非創(chuàng)傷性的產(chǎn)前診斷范圍。

【關(guān)鍵詞】?孕婦;游離胎兒;NDA;表觀遺傳學(xué)方法

文章編號：WHR2020044055

長期以來，產(chǎn)前獲取胎兒組織樣本的方法有絨毛膜取樣、羊膜腔穿刺、臍帶取血，具有創(chuàng)傷性，對胎兒、孕婦有一定危險[1-2]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)母體循環(huán)中存在游離胎兒核酸，開創(chuàng)了非創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷的新紀(jì)元。

1?資料與方法

1.1?一般資料

采用回顧性方法分析，選取本院2018年9月至2019年9月收治的60例孕婦作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）均為單胎妊娠;2）簽署知情同意書，自愿參與此次研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）嚴(yán)重肝腎功能性疾病者;2）存在智力及認(rèn)知障礙者或言語不利等有交流障礙者;3）受試者依從性差。根據(jù)孕期分為早期、中期及晚期，每組20例。同時選取20例非妊娠婦女為對照組，基本資料如下表1所示，各組年齡經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析無顯著差異，具有可比性（P>0.05）。

1.2?方法

所有受試者清晨均空腹抽取3mL靜脈血，將其置入EDTA抗凝劑的試管中10min，按照3000r/min的速度離心15min，吸取上清置于無菌Ep管中，置于-80℃冰箱內(nèi)保存待測。采用QLAGEN公司提供的DNA提取試劑盒，從血漿中提取DNA，嚴(yán)格按照說明書操作。所用引物序列及片段大小如下：基因m-maspin的引物序列（fprward）5′-TTATCGATTTTCGGTTTCGC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為98bp。

基因u-maspin的引物序列（fprward）5′-TTTATTATGAATTGGTTCGT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為98bp。基因β-actin的引物序列（fprward）5′-CTCTTATGCGCACGTATTC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為101bp。

1.3?觀察指標(biāo)

觀察及比較不同組熒光定量PCR結(jié)果。

1.4?統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS?13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以P<0.05表明數(shù)據(jù)對比有顯著差異。

2?結(jié)果

2.1?分析血漿中DNA的純度

四組受試者標(biāo)本的DNA純度較高，A260/A280的比值在1.6～1.8。

2.2?普通PCR擴(kuò)增目的基因及參照β-actin的瓊脂糖電泳結(jié)果

根據(jù)所設(shè)計的引物，目的基因m-maspin、u-maspin的擴(kuò)增產(chǎn)物長度均為98bp。其基因條帶清晰，無引物二聚體，無雜帶。

2.3?熒光定量PCR結(jié)果

對照組血漿中未檢測到u-maspin，特異性為100.0%。其他三組孕婦血漿中均有u-maspin基因，敏感性高達(dá)95.0%。不同妊娠期孕婦的m-maspin基因表達(dá)，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，無顯著差異（P>0.05）。如下表2所示。但不同妊娠期孕婦的u-maspin基因表達(dá)水平，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，有顯著差異（P<0.05）。如下表3所示。

3?討論

孕婦血液血環(huán)中胎兒NDA的存在形式主要有兩種形式，第一種形式為游離在母體血漿或者血清中胎兒NDA，第二種形式為進(jìn)入母體血循環(huán)中的胎兒完整細(xì)胞內(nèi)。已有研究發(fā)現(xiàn)[3-4]：通過定量分析孕婦血漿與血清中胎兒的NDA，可檢測出較高濃度的胎兒NDA，且濃度較相近。最早可見于妊娠7周查到，妊娠7～16周時，胎兒DNA水平較低，在妊娠24周后，胎兒NDA水平穩(wěn)步提高，直至分娩達(dá)到高峰。孕婦血液中發(fā)現(xiàn)胎兒NDA開創(chuàng)了非侵入性的產(chǎn)前診斷途徑，檢測孕婦血液中胎兒NDA，可診斷出軟骨發(fā)育不全、部分染色體易位等疾病。

長期以來，臨床對孕婦外周血中游離胎兒核酸的應(yīng)用多局限在檢測胎兒及父親一方，所檢測的胎兒基因需與母親NDA序列區(qū)分開來。Y染色體NDA序列是一種胎兒的特異性標(biāo)志物，可有效區(qū)分胎兒與孕婦的NDA。而表觀遺傳學(xué)DNA甲基化技術(shù)，可突破母血中檢測胎兒NDA技術(shù)的局限性，取得新進(jìn)展。該技術(shù)拓寬了利用母體血漿中胎兒NDA來診斷胎兒疾病的應(yīng)用范圍[1]。此次數(shù)據(jù)調(diào)查顯示，不同妊娠期孕婦的m-maspin基因表達(dá)無顯著差異，但u-maspin表達(dá)有顯著差異，表明u-maspin基因水平的升高與妊娠進(jìn)展密切相關(guān)，可將其作為孕婦血漿中胎兒游離DNA水平變化的表觀遺傳學(xué)標(biāo)志。

綜上所述，u-maspin基因表達(dá)可作為表觀遺傳學(xué)標(biāo)志，可擴(kuò)大非創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷的應(yīng)用范圍。

參考文獻(xiàn)

[1]?張玢，沈聰，王慧艷，等.孕婦外周血胎兒游離DNA無創(chuàng)產(chǎn)前檢測失敗原因的初步分析[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2018，35（03）：329-333.

[2]?袁路，張富青，劉敏，等.胎兒游離DNA無創(chuàng)產(chǎn)前篩查11067例分析[J].醫(yī)藥論壇雜志，2019，02（05）：34-35.

[3]?胡振儀，朱清華.血清μE3βHCGhAFP聯(lián)合無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測在胎兒染色體非整倍體產(chǎn)前篩查中的應(yīng)用[J].浙江臨床醫(yī)學(xué)，2018，20（08）：678-679.

[4]?蘇文霞.人類胚胎干細(xì)胞中表觀遺傳修飾與基因表達(dá)的相關(guān)研究[D].內(nèi)蒙古：內(nèi)蒙古大學(xué)，2016.