基于多孔石墨碳柱和正辛烷-異丙醇流動(dòng)相的高效液相色譜法分離分析食用油中的甘油三酯

陸湘婷　張世鼎　龔燦　許旭

摘 要 建立了分離食用油中甘油三酯（TAG）的高效液相色譜分析方法。使用多孔石墨碳柱（Hypercarb柱， 100 mm×2.1 mm， 5 μm），以正辛烷-異丙醇（70∶30，V/V）為流動(dòng)相，流速0.25 mL/min，在60℃ 柱溫下分離，檢測(cè)波長215 nm?？疾炝藢?shí)驗(yàn)條件對(duì)分離和檢測(cè)的影響。在優(yōu)化條件下，分離了7種植物油和5種動(dòng)物油中的TAG，借助質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，識(shí)別了玉米油中14種TAG、橄欖油中9種TAG、葵花籽油中14種TAG、大豆油中14種TAG、芝麻油中15種TAG、花生油中18種TAG、菜籽油中17種TAG、雞油中16種TAG、豬油中17種TAG、羊油中12種TAG、牛油中14種TAG和鵝油中16種TAG。在分析雞油和牛油時(shí)，實(shí)現(xiàn)了SLP和SOP與其各自異構(gòu)體的分離，表明本方法具有分離TAG位置異構(gòu)體的能力。采樣本方法分離并分析了玉米油、菜籽油、葵花籽油、大豆油、花生油、芝麻油、橄欖油中的三亞油?；视腿ィ↙LL）的含量。本方法使用的流動(dòng)相污染小、實(shí)用性較好，為食用油中的TAG及其異構(gòu)體的分析提供了有價(jià)值的參考。

關(guān)鍵詞 多孔石墨碳柱; 高效液相色譜法; 質(zhì)譜; 食用油; 甘油三酯; 正辛烷-異丙醇流動(dòng)相

1 引 言

食用油主要由甘油三酯（TAG）、較低量的甘油二酯（DAG）、游離脂肪酸（FAs）、磷脂和其它微量成分組成[1]。其中，TAG是最重要的營養(yǎng)成分，約占95%[2]。它們構(gòu)成了人類飲食的重要組成部分[3]，但過量的攝入會(huì)導(dǎo)致疾病，如心臟病、血脂異常和肥胖等[4，5]。甘油骨架上脂肪酸的多種組合和不同的TAG位置異構(gòu)體使其具有多種結(jié)構(gòu)變化。因此，對(duì)食用油中TAG成分的分析是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的工作。

目前，分離TAG的方法主要有反相高效液相色譜法（RP-HPLC）和高效液相色譜法（HPLC）[6]。 在反相高效液色譜相法中，保留順序基于碳當(dāng)量數(shù)（ECN），其定義為所有?；溨械目偺荚訑?shù)（CN）減去雙鍵數(shù)（DB）的兩倍，即ECN=CN-2DB[7]。因此，洗脫順序取決于ECN，保留時(shí)間隨著ECN的增加而延長，具有相同ECN的TAG可以根據(jù)位置[8]、雙鍵的構(gòu)型[9，10]、脂肪酸的長度和不飽和度進(jìn)行分離。但是，RP-HPLC對(duì)具有相同ECN、但不飽和度不同的TAG的分離選擇性較低。Ag+-HPLC也常用于TAG的分離，基于Ag+與TAG的雙鍵的相互作用，TAG的保留時(shí)間取決于雙鍵的數(shù)量和構(gòu)型[11，12]，并且隨著碳鏈不飽和度的增加而延長[13]。但是，隨著使用時(shí)間延長，Ag+-HPLC柱的穩(wěn)定性下降，重復(fù)性逐漸變差[14～16]。因此，應(yīng)用新型色譜柱的分離方法始終是相關(guān)研究的重點(diǎn)內(nèi)容。

因不同脂肪?；诟视凸羌苌系奈恢貌煌?，甘油三酯存在位置異構(gòu)體。Lísa等[17]利用Ag+-HPLC法分離了OLnLn/LnOLn異構(gòu)體，但難以分離兩個(gè)及以上雙鍵的異構(gòu)體LLnLn/LnLLn。Mikhail等[18]將RP-HPLC和Ag+-HPLC結(jié)合，部分分離了兩對(duì)TAG異構(gòu)體SOO/OSO和OOP/OPO，但分離度不理想。Nagai等[19]利用CHIRALPAK IF-3手性柱分離了由飽和（P或S）和不飽和（O或L）的兩種脂肪酸組成的TAG對(duì)映異構(gòu)體和位置異構(gòu)體。但是，對(duì)于同時(shí)包含飽和與不飽和脂肪酸的3種脂肪酸組成的TAG，如POL、PSO和SOL異構(gòu)體，未充分分離（其中，O、Ln、S、P、L分別指TAG中與甘油連接的油?；喡轷；⒂仓；?、棕櫚?；営王；漤樞蛞来螌?duì)應(yīng)甘油的3個(gè)羥基位置）。

利用多孔石墨碳柱（PGC柱）分離TAG的方法也逐漸得到研究者關(guān)注。PGC色譜柱的剛性和平面表面由六角形排列和共價(jià)鍵合的碳原子組成[20]，耐高壓和高溫，其物理和化學(xué)惰性允許大范圍使用多種溶劑，并且在水性流動(dòng)相的情況下，適用的pH值范圍也較寬。其保留機(jī)制有3種[21]：疏水效應(yīng)和分散相互作用，以及溶質(zhì)的極化和可極化官能團(tuán)與石墨表面的相互作用，稱為石墨的極性保留效應(yīng)（PREG）。近年來，PGC柱已廣泛應(yīng)用于核苷酸分析[22，23]、萜類化合物[24]、糖類[25～27]、酯類[28～31]、異構(gòu)體[32，33]、代謝物[34，35]、生物樣品[36～40]、離子化合物[41]和手性化合物分析[42]。本研究組[43]曾采用PGC柱和甲苯-異丙醇梯度流動(dòng)相的LC-MS分離食用油中的TAG，同時(shí)，總結(jié)出PGC色譜柱中TAG峰保留規(guī)律的特殊順序，定義為S-ECN（S-ECN = 2CN –? – 5uFA）。但是，此方法需要使用質(zhì)譜檢測(cè)，對(duì)設(shè)備的要求較高，而且甲苯毒性高，環(huán)境污染嚴(yán)重。Gaudin等[44]利用脂肪酸甲酯同系物的亞甲基選擇性，研究有多孔石墨碳的非水液相色譜中10種純有機(jī)溶劑洗脫強(qiáng)度，指出其洗脫強(qiáng)度順序如下：甲醇<乙腈<丙酮<異丙醇<乙酸乙酯<庚烷<四氫呋喃≈二氯甲烷<氯仿<甲苯。

本研究建立了一種可用于紫外檢測(cè)的新流動(dòng)相體系，采用PGC柱，以正辛烷-異丙醇為流動(dòng)相，高效液相色譜法等度洗脫分離食用油中的TAG。研究了流動(dòng)相組成、柱溫和流速對(duì)TAG分離的影響，在選定的實(shí)驗(yàn)條件下，通過與質(zhì)譜聯(lián)用，定性識(shí)別色譜峰。本方法顯示出較好的分離與紫外檢測(cè)能力，并降低了對(duì)環(huán)境的污染。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

LCMS-2020型高效液相色譜儀（日本島津公司），配備兩個(gè)LC-30AD二元泵、SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器、SIL-30AC自動(dòng)進(jìn)樣器、CBM-20A脫氣機(jī)、以及CTO-30A柱溫箱、單四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器、APCI離子源; N341M型氮?dú)獍l(fā)生器（美國Proton Energy Systems公司）; Hypercarb柱（2.1 mm ×100 mm， 5 μm， 美國Thermo Scientific公司）

正庚烷、正己烷、異丙醇、乙腈、甲醇、四氫呋喃（色譜純， 上海泰坦科技有限公司）; 正辛烷（色譜純，北京迪馬歐泰科技發(fā)展中心）; 三油酸甘油三酯（OOO）標(biāo)準(zhǔn)品、三亞油酸甘油三酯（LLL）標(biāo)準(zhǔn)品均購自阿拉丁試劑有限公司; 1，3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯（OPO）標(biāo)準(zhǔn)品、1，2-二油酸-3-亞麻酸甘油三酯（OOLn）、1，2-二油酸-3-硬脂酸甘油三酯（OOS）均購自瑞典Larodan精細(xì)化學(xué)品有限公司。所有TAG標(biāo)準(zhǔn)品均冷凍保存。7種植物油（玉米油、橄欖油、芝麻油、葵花籽油、菜籽油、花生油、大豆油）均購自當(dāng)?shù)爻? 5種動(dòng)物油（豬油、雞油、鵝油、羊油、牛油）均自制，冷藏保存。

2.2 TAG標(biāo)準(zhǔn)品和食用油樣品的配制

TAG標(biāo)準(zhǔn)品和食用油樣品均用正己烷溶解，配制成5 mg/mL儲(chǔ)備液，于4℃保存。用流動(dòng)相將儲(chǔ)備液稀釋至0.5 mg/mL，每次進(jìn)樣6 μL，用于HPLC分析。

2.3 色譜和質(zhì)譜條件

液相色譜條件： 流動(dòng)相為正辛烷-異丙醇 （70∶30，V/V），流速0.25 mL/min，溫度60℃，紫外檢測(cè)波長215 nm。

質(zhì)譜條件： APCI電離源，正離子電離模式，質(zhì)荷比范圍m/z 500～1100，APCI源溫度300℃，DL溫度200℃，Heat溫度200℃，霧化氣流速2.5 L/min，干燥氣流速4 L/min，檢測(cè)電壓1.05 kV。分析時(shí)間均為45 min。

2.4 食用油的分離與識(shí)別

取0.5 mg/mL 食用油樣品2 μL，進(jìn)行LC-MS分析，利用流出組分在APCI/MS形成的[M+H]+離子和二?；视退槠x子[M + H-RiCOOH]+鑒定其TAG成分結(jié)構(gòu)。相較于TAG的sn-2位，脂肪酸從同等的sn-1位和sn-3碎裂比較容易，這使得失去sn-1位和sn-3得到的碎片離子相對(duì)豐度比失去sn-2位得到的碎片離子相對(duì)豐度高。因此，TAG骨架上的烷基鏈位置可通過碎片離子[M+H-RCOOH]+的不同豐度識(shí)別[45，46]。

3 結(jié)果與討論

3.1 高效液相色譜條件的選擇

3.1.1 流動(dòng)相的選擇

為了使TAG能用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，分別以正庚烷、正己烷、異丙醇、甲醇、乙腈、四氫呋喃作為流動(dòng)相，比較不同流動(dòng)相體系的分離效果，包括正己烷-異丙醇、正己烷-異丙醇-四氫呋喃、正己烷-異丙醇-乙腈、正庚烷-異丙醇、正庚烷-異丙醇-乙腈、正庚烷-異丙醇-四氫呋喃等。結(jié)果表明，在選定條件（流速0.4 mL/min，溫度50℃，流動(dòng)相比例為80∶20）下，正己烷-異丙醇體系未能分離玉米油中的TAG，而正庚烷-異丙醇體系能夠有效分離9種TAG。分別向其中加入乙腈和四氫呋喃，分離效果相差不大。改變溫度、比例和流速，后者的分離效果均優(yōu)于前者。說明正庚烷-異丙醇體系對(duì)TAG的洗脫能力更強(qiáng)。進(jìn)一步采用同系物正辛烷代替正庚烷，考察流動(dòng)相比例和柱溫的影響。在最優(yōu)流動(dòng)相比例和柱溫條件下，兩種流動(dòng)相體系的玉米油分離譜圖見圖1。通過質(zhì)譜圖推斷出1～10個(gè)色譜峰的TAG種類依次是LLLn、LLL、OLL、OOL、PLL、OOO、POL、SLL/POO、PPL、SOL（可與圖5A和表7中LC-MS的結(jié)果對(duì)比，且本研究均不考慮對(duì)映異構(gòu)體）。其中，正庚烷-異丙醇體系未分離識(shí)別出LLLn。結(jié)果表明，以正辛烷為流動(dòng)相，保留時(shí)間更短，峰數(shù)更多，分離更好。從保留時(shí)間（t）、信噪比（S/N）、峰數(shù)（n）和分離度（Rs）方面對(duì)兩種流動(dòng)相體系的分離能力進(jìn)行比較，結(jié)果見表1，正辛烷-異丙醇體系優(yōu)于正庚烷-異丙醇體系，證明正辛烷的洗脫和分離能力強(qiáng)于正庚烷。因此，本研究選擇使用正辛烷-異丙醇作為流動(dòng)相。有機(jī)溶劑在PGC柱上對(duì)TAG的洗脫強(qiáng)度排列順序可總結(jié)為：甲苯>氯仿>二氯甲烷≈四氫呋喃>正辛烷>正庚烷>乙酸乙酯>異丙醇>丙酮>乙腈>甲醇。相較于甲苯-異丙醇體系，正辛烷-異丙醇體系紫外吸收本底低，能利用紫外檢測(cè)而不采用質(zhì)譜檢測(cè)器，應(yīng)用范圍更廣泛; 相較于甲苯，正辛烷氣味小、毒性低、對(duì)環(huán)境污染小，易于推廣使用，更具實(shí)用性。

3.1.2 檢測(cè)波長的選擇 在選定的條件（柱溫60℃，流速0.25 mL/min，流動(dòng)相為正辛烷-異丙醇（70∶30， V/V））下，考察不同紫外檢測(cè)波長下，玉米油的信噪比。如圖2所示，在205～220 nm波長范圍內(nèi)，4種TAG（LLL、OLL、OOL、PLL）的信噪比均在215 nm處最佳。因此，選擇215 nm為檢測(cè)波長。

Aitzetmulle等[47]測(cè)得不同流動(dòng)相體系（乙醇、乙腈、甲醇、異丙醇、正己烷、四氫呋喃）中TAG最大吸收波長范圍在205～225 nm之間，其中，乙醇-異丙醇-正己烷體系的波長也是215 nm。

3.1.3 流動(dòng)相比例的影響 在選定的條件（波長215 nm，柱溫60℃， 流速0.25 mL/min）下， 考察流動(dòng)相中正辛烷體積比對(duì)分離的影響。 在等度洗脫模式下，以玉米油作為樣品， 不同比例正辛烷（50%～90%， V/V）對(duì)保留時(shí)間、 信噪比、峰數(shù)和分離度的影響見表2。當(dāng)正辛烷的比例增加時(shí)，LLL/OLL的分離度逐漸降低，而OOL/PLL的分離度逐漸增加。在正辛烷比例為60%和70%（V/V）時(shí)，分離所得的TAG的峰（S/N>3）數(shù)最大，且均為10; 但對(duì)于70%正辛烷，LLL、OLL、 OOL、 PLL的信噪比 （分別為 49.9、37.8、 11.0、 17.7）比60%正辛烷 （分別為40.5、30.9、8.2、13.6）更高。由圖3可見，TAG在石墨碳柱上的保留隨正辛烷含量的增加而增加，并且各組分峰的lgk與正辛烷含量具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2>0.99。4種TAG的變化斜率相似，保留順序不受正辛烷含量變化的影響。

比較了等度洗脫模式和梯度洗脫模式， 70%正辛烷在等度洗脫模式下可實(shí)現(xiàn)良好分離。梯度洗脫模式為：0～10 mim，50% 正辛烷;10～25 min， 50%～95% 正辛烷; 25～35 min，95% 正辛烷; 35～40 min， 50%正辛烷; 最后平衡5 min。結(jié)果表明，與等度洗脫相比，梯度洗脫未能顯著提高分離度和信噪比，反而出現(xiàn)基線偏移、分離度下降。采用其它梯度條件，通過提高或降低正辛烷的比例，梯度洗脫的效果也沒有提升。因此，本研究選擇正辛烷-異丙醇（70∶30， V/V）為流動(dòng)相， 采用等度洗脫分離。

3.1.4 溫度的影響 在波長215 nm，流動(dòng)相為正辛烷-異丙醇（70∶30，V/V），流速0.25 mL/min條件下，以玉米油為樣品，考察了溫度（30℃～80℃）對(duì)4種TAG（LLL、OLL、OOL、PLL）分離的影響。如表3所示，隨著溫度升高，TAG的保留降低， LLL/OLL和OOL/PLL的分離度也逐漸降低。但TAG的信噪比大， 增峰數(shù)呈上升的趨勢(shì); 同時(shí)， 保留時(shí)間縮短，流動(dòng)相的洗脫能力加強(qiáng)。? 在60℃和70℃時(shí)， 分離所得的TAG的峰（S/N>3）數(shù)達(dá)到最佳（均為10個(gè)）。兩種溫度下，LLL、OLL、OOL、PLL的信噪比相差不大，同時(shí)，LLL/OLL的分離度相差不大（Rs>2），但是，60℃時(shí)OOL/PLL的分離度（1.35）比70℃時(shí)（1.05）略高，分離更完全。選擇LLL、OLL，OOL和PLL研究lgk和溫度（1/T）之間的關(guān)系。如圖4所示， 隨著溫度升高，保留時(shí)間縮短，分離度下降。在30℃～80℃范圍內(nèi)，4種TAG的lgk-1/T的趨勢(shì)沒有交叉，并且4條關(guān)系曲線均具有良好的線性關(guān)系， 相關(guān)系數(shù)R2>0.99。因此，在30℃～80℃，TAG在石墨碳柱上的保留機(jī)理和保留順序沒有變化; 60℃和70℃的出峰數(shù)相同且最大，但60℃的信噪比和分離度都優(yōu)于70℃。后續(xù)實(shí)驗(yàn)的柱溫選擇60℃。

3.1.5 流速的影響

在波長215 nm，正辛烷-異丙醇（70∶30， V/V）流動(dòng)相，柱溫60℃的條件下，以玉米油為樣品，考察流速（0.2～0.4 mL/min）對(duì)4種TAG（LLL、OLL、OOL、PLL）分離的影響。如表4所示，隨著流速增加，TAG的保留時(shí)間縮短，信噪比增大，但LLL/OLL和OOL/PLL的分離度逐漸減小，柱壓升高。由于不同流速下所得的峰數(shù)相同，為了使信噪比和分離度更大，洗脫時(shí)間更快，選擇0.25 mL/min作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的流速。

3.2 方法學(xué)驗(yàn)證

3.2.1 重復(fù)性 在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，以玉米油為樣品，考察4種TAG（LLL、OLL、OOL、PLL）保留時(shí)間和峰面積的日內(nèi)重復(fù)性和日間重復(fù)性，均重復(fù)6次。日內(nèi)重復(fù)性的保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.34%、0.33%、0.50%和0.29%，峰面積的RSD分別為0.29%、0.49%、0.98%和0.69%。日間重復(fù)性，保留時(shí)間的RSD值分別為0.71%、0.83%、0.72%和0.65%，峰面積的RSD值分別為1.3 %、1.4%、1.2%、1.3%。日內(nèi)重復(fù)性RSD均小于1%，日間重復(fù)性RSD值均小于2%。因此，本方法重復(fù)性較好。

3.2.2 線性范圍、檢出限和定量限 使用LLL、OOO、SOO、OPO和 OOLn作為樣品，考察峰面積和進(jìn)樣溶液中組分含量（μg）之間的線性關(guān)系（表5）。5種TAG在含量范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2>0.99。利用線性回歸方程的殘余標(biāo)準(zhǔn)偏差和斜率計(jì)算檢出限（LOD， 3σ）和定量限（LOQ， 10σ），見表5。

3.2.3 加標(biāo)回收率 LLL、OOO、OOLn、OPO和SOO在食用油中的含量差異較大，選擇含量達(dá)到定量限或不含有此TAG的食用油作為樣品，計(jì)算加標(biāo)回收率。玉米油中LLL的含量達(dá)到定量限; 橄欖油中OOO的含量達(dá)到定量限，并且不含有OOLn、OPO和SOO。因此，選擇這兩種油作為樣品分別計(jì)算5種TAGs的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。分別取3種不同濃度的LLL、OOO、OOLn、OPO和SOO標(biāo)準(zhǔn)品，分別加入到玉米油或橄欖油中，各加標(biāo)水平均重復(fù)3次。結(jié)果（表6）表明，LLL、OOO、OOLn、OPO和SOO的加標(biāo)回收率在91.7%～108.9%之間，RSD均小于4%。

3.3 利用LC-MS定性鑒別食用油樣品中的TAG

采用PGC柱，以正辛烷-異丙醇為流動(dòng)相，結(jié)合LC-MS對(duì)7種植物油和5種動(dòng)物油進(jìn)行分析，總離子流圖見圖5和圖6。根據(jù)2.5節(jié)的方法鑒別12種食用油中的TAG。結(jié)果表明，鑒別出玉米油中14種TAG、橄欖油中9種TAG、葵花籽油中14種TAG、大豆油中14種TAG、芝麻油中15種TAG、花生油中18種TAG、菜籽油中17種TAG、雞油中16種TAG、豬油的17種TAG、羊油中的12種TAG、牛油中14種TAG和鵝油中16種TAG（S/N>3）。玉米油和豬油TAG的定性鑒別結(jié)果分別見表7和表8。

計(jì)算結(jié)果顯示，各種油樣中TAG的順序與本研究組采用甲苯流動(dòng)相研究得出的結(jié)果[41]一致，均符合：

S-ECN=2CN-3DB-5uFA（1）

其中， S-ECN為碳當(dāng)量數(shù)，CN為總碳原子數(shù)，DB為雙鍵數(shù)和uFA為不飽和脂肪酸數(shù)。結(jié)果表明，正辛烷-異丙醇體系與甲苯-異丙醇體系具有相似的保留機(jī)理。

PGC具有剛性和平面表面，對(duì)TAG具有很強(qiáng)的保留，正辛烷作為流動(dòng)相，與溶質(zhì)在PGC表面發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，促進(jìn)不同TAGs的洗脫和分離。通過與質(zhì)譜聯(lián)用，分析12種食用油， TAG的出峰順序與方程（1）一致，表明此規(guī)律有助于推測(cè)TAG的保留及識(shí)別色譜峰。采用PGC柱的高效液相色譜法中，部分TAG的保留順序與反相液相色譜的模式存在明顯差異，表明TAG組分中不飽和脂肪酸（即不飽和?；┑膫€(gè)數(shù)增加，會(huì)降低其在PGC柱的保留。

3.4 利用LC-MS分析TAG位置異構(gòu)體

在對(duì)雞油和牛油分析譜峰的定性識(shí)別時(shí)，PGC柱對(duì)TAG位置異構(gòu)體有一定的分離能力。SOP/SPO（或/和PSO，下文直接簡(jiǎn)寫成PSO，詳見下面的討論）和PSL/SPL（或/和PSL）兩對(duì)位置異構(gòu)體的分離情況

（因?yàn)橘|(zhì)譜識(shí)別的特點(diǎn)，未考慮對(duì)映體的差異，sn-1位和sn-3位的脂肪酸可能互換或者兩者同時(shí)存在）如圖7所示，PLS的保留時(shí)間比SPL（PSL）短，SOP的保留時(shí)間也比SPO（PSO）短。這兩對(duì)異構(gòu)體中碎片離子的相對(duì)豐度如圖8所示，與sn-1和sn-3位置上的碎裂?；腫M+H-RCOOH]+離子相對(duì)豐度比相比，sn-2位置上碎裂?；腫M+H-RCOOH]+離子相對(duì)豐度更低，這可能是由于立體定向的阻斷作用[47，48]。圖8A中[SP]+/[SL]+和[SP]+/[PL]+兩對(duì)豐度比均為0.70，僅[SP]+小，可以直接識(shí)別為SLP; 而圖8B中，兩者均在2.46附近，[SL]+和[PL]+都小，故推測(cè)圖8B可能為SPL或者PSL，也可能是兩者的混合物（簡(jiǎn)寫成SPL（PSL））。同樣，圖8C僅[SP]+小，故識(shí)別為SOP，而圖8D中[SO]+和[PO]+都小，故推測(cè)圖8D可能為SPO或PSO，也可能是兩者的混合物（簡(jiǎn)寫成SPO（PSO））。

在非水反相色譜法中，在TAG的sn-1位或sn-3位含有的不飽和脂肪酸越多，保留時(shí)間越長[49]。而本研究中，當(dāng)TAG中不飽和脂肪酸位于sn-1位或sn-3位時(shí)，其保留明顯比其位于sn-2位的TAG更強(qiáng)。這說明當(dāng)不飽和脂肪酸位于sn-1位或sn-3位時(shí)，不飽和脂肪酸更易與PGC柱的表面產(chǎn)生強(qiáng)烈的相互作用，使得吸附更緊密，保留增強(qiáng)。上述異構(gòu)體的分離也有類似現(xiàn)象。

3.5 HPLC-UV法定量分析食用油樣品

將建立的HPLC-UV方法用于不同食用油樣品的定量分析，每個(gè)油樣重復(fù)測(cè)定3次?？紤]到目前僅LLL的紫外檢測(cè)靈敏度較好（對(duì)其它TAG成分檢測(cè)靈敏度的改進(jìn)還在研究中），僅定量分析了植物油中的LLL。如表9所示，檢測(cè)的植物油中均含有LLL，其中，橄欖油和菜籽油中的LLL含量相對(duì)較低，其它植物油中LLL的含量均大于0.1 g/g。

4 結(jié) 論

建立了使用PGC柱和正辛烷-異丙醇流動(dòng)相，在紫外檢測(cè)條件下分離食用油中TAG的高效液相色譜方法。考察了實(shí)驗(yàn)條件對(duì)分離和檢測(cè)的影響。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，分離了7種植物油和5種動(dòng)物油中的TAG，與質(zhì)譜聯(lián)用，對(duì)不同食用油中的TAG成分進(jìn)行了定性鑒別，顯示本方法可以分離TAG的兩對(duì)異構(gòu)體PLS/SPL（PSL）和SOP/SPO（PSO）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，有機(jī)溶劑在PGC柱上對(duì)TAG的洗脫強(qiáng)度排列順序?yàn)椋杭妆?氯仿>二氯甲烷≈四氫呋喃>正辛烷>正庚烷>乙酸乙酯>異丙醇>丙酮>乙腈>甲醇。正辛烷-異丙醇流動(dòng)相與甲苯流動(dòng)相用于PGC柱分離TAG具有相似的保留機(jī)理。采用本方法測(cè)定了玉米油、菜籽油、葵花籽油、大豆油、花生油、芝麻油、橄欖油中LLL的含量。本方法對(duì)食用油中的TAG及其異構(gòu)體的分析具有良好的的參考價(jià)值。

References

1 Indelicato S， Bongiorno D， Pitonzo R， Di Stefano V， Calabrese V， Indelicato S， Avellone G. J. Chromatogr. A，? 2017， 1515： 1-16

2 Yang Y， Ferro M D， Cavaco I， Liang Y. J. Agric. Food Chem.，? 2013， 61（15）： 3693-3702

3 Mensink R P， Katan M B. New Engl. J. Med.， 1989， 321（7）： 436-441

4 Walker G E， Marzullo P， Ricotti R， Bona G， Prodam F. Horm. Mol. Biol. Clin. Invest.，? 2014， 19（1）： 57-74

5 Dugo P， Kumm T， Crupi M L， Cotroneo A， Mondello L. J. Chromatogr. A，? 2006， 1112（1-2）： 269-275

6 HU Jun， WEI Fang， DONG Xu-Yan， LYU Xin， LI Guang-Ming， CHEN Hong. Journal of Instrumental Analysis， 2012， 31（6）： 749-756

胡 珺， 魏 芳， 董緒燕， 呂 昕， 李光明， 陳 洪. 分析測(cè)試學(xué)報(bào)， 2012， 31（6）： 749-756

7 Holcapek M， Lísa M， Jandera P， Kabátová N. J. Sep. Sci.，? 2005， 28（12）： 1315-1333

8 Francois I， Pereira A S， Sandra P. J. Sep. Sci.，? 2010， 33（10）： 1504-1512

9 van der Klift E J C， Vivó-Truyols G， Claassen F W， van Holthoon F L， van Beek T A. J. Chromatogr. A，? 2008， 1178（1-2）： 43-55

10Leskinen H， Suomela J， Pinta J， Kallio H. Anal. Chem.，? 2008， 80（15）： 5788-5793

11 Li L， Han J， Wang Z， Liu J， Wei J， Xiong S， Zhao Z. Int. J. Mol. Sci.，? 2014， 15（6）： 10492-10507

12 Momchilova S， Nikolova-Damyanova B. J. Sep. Sci.，? 2003， 26（3-4）： 261-270

13 Michal H， Hana V， Miroslav L， Petr C. J. Sep. Sci.，? 2009， 32（21）： 3672-3680

14 Beccaria M， Sullini G， Cacciola F， Donato P， Dugo P， Mondello L. J. Chromatogr. A，? 2014， 1360： 172-187

15 Acheampong A， Leveque N， Tchapla A， Heron S. J. Chromatogr. A，? 2011， 1218（31）： 5087-5100

16 Rezanka T， Pádrová K， Sigler K. Anal. Biochem.，? 2016， 524： 3-12

17 Lísa M， Velínsk H， Holcapek M. Anal. Chem.，? 2009， 81（10）： 3903-3910

18 Vyssotski M， Bloor S J， Lagutin K， Wong H， Williams D B G. J. Agric. Food Chem.，? 2015， 63（26）： 5985-5992

19 Nagai T， Kinoshita T， Kasamatsu E， Yoshinaga K， Mizobe H， Yoshida A， Yutaka I， Gotoh N. J. Oleo Sci.，? 2019， 68（10）： 1019-1026

20 Roy S， Delobel A， Gaudin K， Touboul D， Germain D P， Baillet A， Prognon P， Laprévote O， Chaminade P. J. Chromatogr. A，? 2006， 1117（2）： 154-162

21 West C， Lesellier E， Tchapla A. J. Chromatogr. A，? 2004， 1048（1）： 99-109

22 Wang T， Chen X， Li L， Cao Y， Zhao L， Chai Y， Zhu Z， Lou Z. Anal. Lett.，? 2014， 47（2）： 234-249

23 Crauste C， Lefebvre I， Hovaneissian M， Puy J Y， Roy B， Peyrottes S， Cohen S， Guitton J， Dumontet C， Perigaud C. J. Chromatogr. B，? 2009， 877（14-15）： 1417-1425

24 Rhourri-Frih B， Chaimbault P， Dequeral D， André P， Lafosse M. J. Chromatogr. A，? 2012， 1240： 140-146

25 Zhou S， Huang Y， Dong X， Peng W， Veillon L， Kitagawa D A S， Aquino A J A， Mechref Y. Anal. Chem.，? 2017， 89（12）： 6590-6597

26 Apel N， Uliyanchenko E， Moyses S， Rommens S， Wold C， Macko T， Rode K， Brüll R. J. Chromatogr. A，? 2017， 1488： 77-84

27 Hinneburg H， Chatterjee S， Schirmeister F， Nguyen-Khuong T， Packer N H， Rapp E， Thaysen-Andersen M. Anal. Chem.，? 2019， 91（7）： 4559-4567

28 Viron C， André P， Dreux M， Lafosse M. Chromatographia， 1999， 49（3）： 137-141

29 Cassela S， Chaimbaulta P， Debaigb C， Benvegnub T， Claudec S， Plusquellecb D， Rollina P， Lafossea M. J. Chromatogr. A，? 2001， 919（1）： 95-106

30 Gaudin K， Hanai T， Chaminade P， Baillet A. J. Chromatogr. A，? 2007， 1157（1-2）： 56-64

31 Merelli B， De Person M， Favetta P， Lafosse M. J. Chromatogr. A，? 2007， 1157（1-2）： 462-466

32 Svetlov D A， Yashkina E A， Popov A S， Yashkin S N. Russ. Chem. B，? 2015， 64（2）： 458-463

33 Matteis C I D， Simpson D A， Doughty S W， Euerby M R， Shaw P N， Barrett D A. J. Chromatogr. A，? 2010， 1217（： 6987-6993

34 Szoboszlai N， Guo X， Ozohanics O， Oláh J， Gmry ， Mihucz V G， Jeney A， Vékey K. Anal. Chim. Acta，? 2014， 819： 108-115

35 Lunn D B， Yun Y J， Jorgenson J W. J. Chromatogr. A，? 2017， 919（1）： 95-106

36 He X， Gabler J， Yuan C， Wang S， Shi Y， Kozak M. J. Chromatogr. B，? 2011， 879（23）： 2355-2359

37 Virus E D， Luzyanin B P， Ivanov A V， Kubatiev A A. Rapid Commun. Mass Spectrom.，? 2015， 29（19）： 1779-1788

38 Geballa-Koukoula A， Panderi I， Zervas K， Geballa-Koukoulas K， Kavvalou E， Panteri-Petratou E， Vourna P， Gennimata D. J. Chromatogr. B，? 2018， 1084： 175-184

39 Rey V， Botana A M， Antelo A， Alvarez M， Botana L M. Food Chem.，? 2018， 269： 166-172

40 Saitoh K， Soeta N， Minamisawa H， Shibukawa M. Anal. Sci.，? 2013， 29（7）： 715-721

41 Chirita R， Finaru A， Elfakir C. J.Chromatogr. B，? 2011， 879（9-10）： 633-640

42 Lecoeur-Lorin M， Delépée R， Adamczyk M， Morin P. J. Chromatogr. A，? 2008， 1206（2）： 123-130

43 Zhang S， Gong C， Lu Y， Xu X. J. Am. Oil. Chem. Soc.，? 2018， 95（10）： 1253-1266

44 Gaudin K， Chaminade P， Baillet A. J. Chromatogr. A，? 2002， 973（1-2）： 61-68

45 ezanka T， Pádrová K， Sigler K. Anal. Biochem.，? 2017， 524： 3-12

46 Annamaria J， Karoly H， Esther F. J. Chromatogr. A，? 2002， 976： 255-263

47 Aitzetmuller K， Grnheim M. J. High Resolut. Chromatogr.， 1992， 15： 219-226

48 ezanka T， Vítová M， Nováková A， Sigler K. Lipids，? 2015， 50（8）： 811-820

49 Hu J， Wei F， Dong X， Lv X， Jiang M， Li G， Chen H. J. Sep. Sci.，? 2013， 36： 288-300

50 Sompila A W G T， Héron S， Hmida D， Tchapla A. J. Chromatogr. B，? 2017， 1041： 151-157

Separation and Determination of Triacylglycerols in Edible Oils

by High Performance Liquid Chromatography with

Porous Graphite Carbon Column and

n-Octane-isopropanol Mobile Phase

LU Xiang-Ting， ZHANG Shi-Ding， GONG Can， XU Xu*

（School of Chemical and Environmental Engineering， Shanghai Institute of Technology， Shanghai 201418， China）

Abstract High performance liquid chromatography with porous graphite carbon （PGC） columns and a n-octane-isopropanol mobile phase was used to separate triacylglycerols （TAGs） in edible oils. The samples were separated by a Hypercarb column （2.1 mm × 100 mm， 5 μm） with n-octane-isopropanol （70∶30， V/V） as mobile phase at a flow rate of 0.25 mL/min and column temperature of 60℃， with detection wavelength of 215 nm. The experimental conditions were optimized. Then， TAGs in 7 vegetable oils and 5 animal fats were separated under the selected experimental conditions. A total of 14 TAGs in corn oil， 9 TAGs in olive oil， and 14 TAGs in sunflower oil， 14 TAGs in soybean oil， 15 TAGs in sesame oil， 18 TAGs in peanut oil， 16 TAGs in rapeseed oil， 19 TAGs in chicken fat， 19 TAGs in lard， 12 TAGs in sheep fat， 13 TAGs in beef tallow and 16 TAGs in goose fat were identified by combining with mass spectrometry. By means of analysis of chicken fat and beef tallow， it was found that the SLP and SOP could be all separated with their respective isomers， which indicated that the system could separate the TAG isomers. The method was validated and applied to determine LLL in corn oil， rapeseed oil， sunflower seed oil， soybean oil， peanut oil， sesame oil and olive oil. The practical method used less-polluting mobile phase to provide a valuable method for the analysis of triacylglycerols and its isomers in edible oil.

Keywords Porous graphite carbon column; High performance liquid chromatography; Mass spectrometry; Edible oils; Triacylglycerols; n-Octane-isopropanol mobile phase

（Received 6 January 2020; accepted 26 February 2020）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 31671928） and the Natural Science Foundation of Shanghai， China （No. 15ZR1440800）

2020-01-06收稿; 2020-02-26接受

本文系國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No. 31671928）和上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No. 15ZR1440800）資助

* E-mail： xuxu3426@sina.com