無創(chuàng)胚胎染色體篩查技術對單囊胚凍胚復蘇移植臨床結局的影響▲

肖 露 權 利 梁紅星 廖美霞 范曉波 陳西平 李寶香 涂 劍

(湖南省岳陽市婦幼保健院生殖醫(yī)學中心，岳陽市 414000，電子郵箱：xl2012cy@163.com)

染色體篩查是輔助生殖技術(assisted reproductive technology,ART)的重要組成部分。胚胎植入前遺傳學篩查(preimplantation genetic screening,PGS)是胚胎染色體篩查的重要技術手段，它能提高臨床妊娠率，降低早期流產率，并減少畸形兒的出生[1]。但PGS是一種有創(chuàng)的染色體篩查技術，可能會對胚胎后續(xù)發(fā)育造成潛在的、尚未知曉的影響。無創(chuàng)胚胎染色體篩查技術(noninvasive chromosome screening,NICS)通過檢測胚胎培養(yǎng)液及囊腔液樣本分析胚胎染色體的拷貝數，其結果與胚胎樣本染色體拷貝數高度相關，敏感性和特異性均高達80%以上[2]。但目前未見有關NICS檢測提示染色體正常的囊胚移植的臨床結局的研究報道。本研究比較NICS檢測提示為染色體正常的囊胚移植與Gardner囊胚評分[3]法評估為形態(tài)學質量為優(yōu)的囊胚移植之間的臨床結局，探討NICS檢測對單囊胚移植臨床結局的影響，旨在為ART周期中運用NICS檢測染色體提供臨床依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2016年11月至2019年9月在我院生殖醫(yī)學中心行體外受精-胚胎移植(invitrofertilization-embryo transfer,IVF-ET)的372例不孕夫婦(372個移植周期)的臨床資料。納入標準：(1)女方年齡35～40歲；(2)ART周期中獲卵≥15個或者人絨毛促性腺激素注射當日血清雌二醇水平≥5 000 pg/mL；(3)18 kg/m2≤女方體質指數≤28 kg/m2；(4)同意選擇單囊胚凍胚復蘇移植；(5)根據Gardner囊胚評分法評估形態(tài)學質量，符合移植條件的囊胚數≥2個；(6)無內科并發(fā)癥；(7)符合國家計劃生育政策。排除標準：(1)夫妻任一方有ART治療禁忌證；(2)女方既往自發(fā)性流產>3次；(3)女方單側卵巢切除；(4)有如下明確原因的不孕患者，如單側或雙側輸卵管積液、瘢痕子宮、子宮畸形、子宮內膜異位癥、子宮腺肌癥、子宮內膜息肉、宮腔粘連或其他影響子宮內膜環(huán)境的病變；(5)女方患有不宜生育的嚴重遺傳性疾病、嚴重軀體疾病、精神心理障礙等。在移植前所有囊胚形態(tài)學質量經Gardner囊胚評分[3]評估都符合移植要求。將其中愿意接受NICS檢測并且檢測結果顯示囊胚染色體拷貝數正常的75例，設為染色體拷貝數正常囊胚移植組(A組)；愿意接受NICS檢測并且檢測結果顯示囊胚染色體拷貝數異常的73個優(yōu)質囊胚將不用于臨床移植，不納入任何一組；其余224例設為形態(tài)學優(yōu)質囊胚移植組(B組)。兩組的女方年齡、不孕年限、體質指數和移植日子宮內膜厚度比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見表1。本研究已通過岳陽市婦幼保健院醫(yī)學倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

表1 兩組間基本資料的比較(x±s)

1.2 IVF-ET及NICS檢測 所有女方均接受本中心常規(guī)采用的促性腺激素釋放激素激動劑降調節(jié)進行超排卵：采用早卵泡期長效長促排卵方案，月經第1～4天行陰道B超和血促卵泡激素、黃體生成素、雌二醇、孕酮檢查，予以注射長效達菲林(生產廠家：Ipsen Pharma Biotech；規(guī)格：3.75 mg/支)3.75 mg，28～30 d后復查陰道B超和血促卵泡激素、促黃體生成素、雌二醇、孕酮值。若達到降調標準(降調標準：卵泡直徑≤5～8 mm、子宮內膜≤5 mm、雌二醇<50 pg/mL、促卵泡激素及促黃體生成素<5 mIU/mL、孕酮<0.9 ng/mL)，予以注射Gn(果納芬，生產廠家：MerckSeronoS.p.A；規(guī)格：300 IU/0.5 mL)啟動。至扳機時機(扳機時機：主導卵泡群直徑≥17 mm與≥14 mm卵泡數的比值達60%～70%)，予注射艾澤(規(guī)格：250 μg:0.5 mL)扳機。扳機后36 h采卵，行體外受精。兩組均行體外受精，將受精卵置于培養(yǎng)箱內采用G-1TM培養(yǎng)液(瑞典Vitrolife公司,型號：10128)行單微滴單胚胎培養(yǎng)72 h后，換G-2TM(瑞典Vitrolife公司,型號：10132)囊胚培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)液為Vitrolife公司G5系列培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱為美國COOK公司K-MINC-1000型培養(yǎng)箱。

培養(yǎng)至120 h(D5)～144 h(D6)，行形態(tài)學評估后，對接受NICS檢測的患者囊胚進行激光皺縮，5～10 min后取30 μL囊胚培養(yǎng)液，送億康基因有限公司進行NICS檢測(多次退火環(huán)狀循環(huán)擴增技術單細胞全基因組擴增+高通量測序)，篩選染色體正常胚胎進行移植；不接受NICS檢測的形態(tài)學優(yōu)質囊胚直接進行移植[3-4]。

1.3 觀察指標 觀察兩組患者的臨床結局，包括臨床妊娠率、早期流產率、持續(xù)妊娠率、異位妊娠率、活產率、新生兒畸形率。判斷標準：移植后4周行B超檢查，宮腔內見妊娠囊確定為臨床妊娠；發(fā)生在孕12周以前的流產定義為早期流產；持續(xù)妊娠是指懷孕持續(xù)到20周或以后；發(fā)生在子宮底或子宮體之外的妊娠定義為異位妊娠，異位妊娠亦記為臨床妊娠；胎兒分娩后，存在呼吸或其他生命征象(如心臟跳動等)均被定義為活產嬰兒；胎兒出生前已經存在的結構或功能異常為新生兒畸形。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植總周期數×100%；早期流產率=早期流產周期數/臨床妊娠周期數×100%；持續(xù)妊娠率=持續(xù)妊娠周期數/臨床妊娠周期數×100%；異位妊娠率=異位妊娠周期數/臨床妊娠周期數×100%；活產率=有活產周期數/移植總周期數×100%；新生兒畸形率=畸形嬰兒數/活產嬰兒數×100%。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 23.0和GraphPad Prism 7進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用兩樣本獨立t檢驗；計數資料以例數或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 NICS檢測情況 對148枚Gardner囊胚評分法形態(tài)學質量為優(yōu)的囊胚(見圖1)進行NICS檢測，結果提示75枚Gardner囊胚評分法形態(tài)學質量為優(yōu)的囊胚的染色體拷貝數正常，其余73枚Gardner囊胚評分法形態(tài)學質量為優(yōu)的囊胚的染色體拷貝數異常(見圖2)，包括39枚為非整倍體，22枚為嵌合體，12枚為染色體檢測結果不明確。將NICS檢測染色體拷貝數正常的Gardner囊胚評分法形態(tài)學質量為優(yōu)的囊胚進行移植，而染色體拷貝數異常的Gardner囊胚評分法形態(tài)學質量為優(yōu)的囊胚終止ART周期。

圖1 D5～D6 Gardner囊胚評分法形態(tài)學質量為優(yōu)的囊胚

圖2 NICS檢測形態(tài)學優(yōu)質囊胚的染色體拷貝數結果

2.2 兩組臨床結局比較 A組的新生兒畸形率低于B組，活產率高于B組(均P<0.05)；但兩組之間的臨床妊娠率、早期流產率、持續(xù)妊娠率和異位妊娠率差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表2。

表2 兩組臨床結局比較

3 討 論

隨著二孩政策的全面放開，許多高齡女性渴望再生育，但隨著年齡的增長，女性生殖能力逐漸下降，尤其35歲以后下降更為明顯。這促使有生育要求的高齡孕婦選擇通過ART來實現生育。研究表明，ART受孕與自然受孕的新生兒出生缺陷發(fā)生率差異無統(tǒng)計學意義[5-8]。但通過ART方式獲得的胚胎，仍有40%～60%存在染色體異常，且隨孕婦年齡增大，染色體異常的風險呈上升趨勢[9]。而胚胎染色體異常時導致ART失敗的主要原因[10]。ART周期中PGS是胚胎染色體篩查的重要技術手段，采用PGS進行胚胎染色體篩查，可降低試管嬰兒流產率，提高臨床妊娠率[11-12]。但PGS的標本采集方式對胚胎存在一定的創(chuàng)傷。研究表明，有創(chuàng)性的活檢有可能會引起胚胎發(fā)育節(jié)點時間延長，并造成表觀遺傳修飾異常[13-14]和胎盤異常[15-16]等不利影響。

本研究中，A組的新生兒畸形率低于B組，而活產率高于B組(P<0.05)；但兩組之間的臨床妊娠率、持續(xù)妊娠率、早期流產率、異位妊娠率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究對Gardner囊胚評分法形態(tài)學質量為優(yōu)的囊胚進行NICS檢測，發(fā)現這些囊胚部分亦存在染色體拷貝數異常，這種異常可能導致某些基因(如MPP1)的缺失、減少或增多[17]，從而導致活產率降低和新生兒畸形率升高[18]。

綜上所述，與單純傳統(tǒng)胚胎形態(tài)學評分比較，聯合NICS能夠提高單囊胚凍胚復蘇移植的活產率，降低新生兒畸形率。這為臨床ART周期中染色體篩查提供新的思路，而合理應用NICS能更好地實現ART技術中優(yōu)生優(yōu)育的目的。但由于本研究為單中心回顧性研究，同時周期數量有限，所得結果可能存在一定的偏差，今后還需進一步進行多中心、多周期的前瞻性或回顧性研究以驗證。