HPLC梯度洗脫法同時測定通脈降糖膠囊中7種成分含量△

楊濱，王海樂

1.華北石油二部醫(yī)院 中醫(yī)科，河北 任丘 062552；2. 湖南省藥品檢驗(yàn)研究院，湖南 長沙 410001

糖尿病是當(dāng)今社會嚴(yán)重危害人類健康的十大疾病之一，是一種因胰島素分泌缺陷或胰島素作用障礙所致的以高血糖為特征的代謝性疾病，具有多食、多飲、多尿、消瘦等“三多一少”的典型臨床癥狀，其發(fā)病與患者年齡、文化程度、職業(yè)、環(huán)境及遺傳等因素相關(guān)，中醫(yī)將其歸屬為“消渴病”。通脈降糖膠囊現(xiàn)收載于國家藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS-11213(ZD-1213)-2002-2012Z，由黃芪、太子參、絞股藍(lán)、丹參、黃連、葛根等11味中藥加工而成，主要用于氣陰兩虛、脈絡(luò)瘀阻所致的消渴病(糖尿病)，證見神疲乏力、肢麻疼痛、頭暈耳鳴、自汗等病癥的治療[1]?，F(xiàn)代研究表明，通脈降糖膠囊可顯著降低患者全血黏度[2]，對糖尿病腎病[3-4]、糖尿病周圍神經(jīng)病變[5-7]、改善2型糖尿病并腦梗死恢復(fù)期患者預(yù)后[8-9]，臨床治療效果顯著。中藥制劑具有多組分、多靶點(diǎn)和整體調(diào)節(jié)的特點(diǎn)，現(xiàn)有的單組分質(zhì)量評價模式難以全面評價中藥制劑的內(nèi)在質(zhì)量，多指標(biāo)成分評價模式已逐步應(yīng)用于制藥及其制劑的質(zhì)量控制中，通脈降糖膠囊現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對方中臣藥黃連所含鹽酸小檗堿進(jìn)行單成分定量控制，未對方中君藥黃芪、玄參及其他藥物所含成分進(jìn)行定量研究，也未檢索到對通脈降糖膠囊多組分質(zhì)量控制的文獻(xiàn)報道。本文采用HPLC梯度洗脫法，參考中藥質(zhì)量標(biāo)志物確定原則，選取方中君藥黃芪的活性成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和芒柄花素，臣藥太子參的活性成分太子參環(huán)肽B，佐藥絞股藍(lán)的特征成分絞股藍(lán)皂苷XLIX、絞股藍(lán)皂苷A和絞股藍(lán)皂苷ⅩⅦ為檢測目標(biāo)成分，實(shí)現(xiàn)對通脈降糖膠囊中多個組分的同時測定，為進(jìn)一步完善通脈降糖膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，確保其產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性和臨床治療效果的一致性提供數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Shimadzu LC-2010型高效液相色譜儀、AUW120D型電子天平(日本島津公司)；YQ-1000A型超聲波清洗器(上海易凈超聲波儀器廠)。

1.2 試藥

毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111920-201606，CAS號：20633-67-4，純度：97.6%)；芒柄花苷對照品(批號：PRF8081121，CAS號：486-62-4，純度：99.6%)、芒柄花素對照品(批號：PRF8091225，CAS號：485-72-3，純度：99.9%)、絞股藍(lán)皂苷XLIX對照品(批號：PRF8040744，CAS號：94987-08-3，純度：99.5%)、絞股藍(lán)皂苷ⅩⅦ對照品(批號：PRF8092143，CAS號：80321-69-3，純度：97.7%)均來源于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；太子參環(huán)肽B對照品(上海同田生物技術(shù)股份有限公司,批號：18031328，CAS號：145459-19-4，純度：99.9%)；絞股藍(lán)皂苷A對照品(武漢天植生物技術(shù)有限公司,批號：CFS201702，CAS號：157752-01-7，純度：98.0%)；通脈降糖膠囊(保定天浩制藥有限公司，規(guī)格：每粒裝0.4 g，批號分別為：181103、181202、190403)；乙腈為色譜純(德國Merck公司)；其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1混合對照品溶液 精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、太子參環(huán)肽B、絞股藍(lán)皂苷XLIX、絞股藍(lán)皂苷A和絞股藍(lán)皂苷ⅩⅦ對照品各適量，用甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.752、0.438、1.024、0.172、1.596、1.718、2.392 mg·mL-1的7個對照品儲備液；精密量取7個對照品儲備液各2.5 mL，用甲醇制成質(zhì)量濃度分別為37.6、21.9、51.2、8.6、79.8、85.9、119.6 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.1.2供試品溶液 取通脈降糖膠囊樣品適量，傾出內(nèi)容物，混勻，取2.0 g，精密稱定，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱質(zhì)量，YQ-1000A型超聲波清洗器超聲處理30 min，取出，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，續(xù)濾液作為通脈降糖膠囊供試品溶液。

2.1.3陰性樣品溶液 按通脈降糖膠囊制劑處方比例和制法，分別制備缺黃芪、缺太子參和缺絞股藍(lán)的3種陰性樣品，再按2.1.2項(xiàng)下方法制成陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件及專屬性試驗(yàn)

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫：25 ℃；流動相乙腈(A)-0.3%甲酸溶液(B)，梯度洗脫(0～10.0 min，9.0%A；10.0～25.0 min，9.0%～20.0%A；25.0～36.0 min，20.0%～32.0%A；36.0～51.0 min，32.0%～40.0%A；51.0～60.0 min，40.0%～9.0%A)；體積流量：1.0 mL·min-1；檢測波長分別為260 nm[10-11](0～25.0 min檢測毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和芒柄花素)和203 nm[12-15](25.0～60.0 min檢測太子參環(huán)肽B、絞股藍(lán)皂苷XLIX、絞股藍(lán)皂苷A和絞股藍(lán)皂苷ⅩⅦ)；進(jìn)樣量：10 μL。精密吸取2.1.1項(xiàng)下混合對照品溶液以及2.1.2、2.1.3項(xiàng)下制備的各溶液適量，依法進(jìn)樣檢測，記錄所檢測色譜圖。結(jié)果所記錄色譜圖基線平穩(wěn)，通脈降糖膠囊供試品溶液色譜圖中待測成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、太子參環(huán)肽B、絞股藍(lán)皂苷XLIX、絞股藍(lán)皂苷A和絞股藍(lán)皂苷ⅩⅦ與其他雜質(zhì)成分均能達(dá)到有效分離，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按所測成分計均不低于4500，陰性樣品對通脈降糖膠囊中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、太子參環(huán)肽B、絞股藍(lán)皂苷XLIX、絞股藍(lán)皂苷A和絞股藍(lán)皂苷ⅩⅦ的同時測定無干擾，色譜圖見圖1。

注：A.混合對照品；B.供試品；C.黃芪陰性樣品；D.太子參陰性樣品；E.絞股藍(lán)陰性樣品；1. 毛蕊異黃酮葡萄糖苷；2. 芒柄花苷；3. 芒柄花素；4. 太子參環(huán)肽B；5. 絞股藍(lán)皂苷XLIX；6. 絞股藍(lán)皂苷A；7. 絞股藍(lán)皂苷ⅩⅦ。圖1 通脈降糖膠囊及對照品、陰性樣品HPLC圖

2.3 線性關(guān)系考察

精密吸取2.1.1項(xiàng)下7個對照品儲備液各0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分別置于6個20 mL量瓶中，用甲醇制成各待測成分25倍質(zhì)量濃度差的6個混合對照品溶液，依法進(jìn)樣檢測，記錄毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、太子參環(huán)肽B、絞股藍(lán)皂苷XLIX、絞股藍(lán)皂苷A和絞股藍(lán)皂苷ⅩⅦ的峰面積，以質(zhì)量濃度(X，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

2.4 精密度試驗(yàn)

取混合對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、太子參環(huán)肽B、絞股藍(lán)皂苷XLIX、絞股藍(lán)皂苷A和絞股藍(lán)皂苷ⅩⅦ的峰面積，結(jié)果待測目標(biāo)成分峰面積的RSD分別為1.16%、1.21%、0.99%、1.37%、1.01%、0.69%和0.53%。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取通脈降糖膠囊同一批次樣品適量，按2.1.2項(xiàng)下方法平行制備6份通脈降糖膠囊樣品溶液，依法進(jìn)樣測定，記錄毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、太子參環(huán)肽B、絞股藍(lán)皂苷XLIX、絞股藍(lán)皂苷A和絞股藍(lán)皂苷ⅩⅦ的峰面積，計算各待測目標(biāo)成分含量。結(jié)果7個待測目標(biāo)成分含量的RSD分別為1.44%、0.72%、1.56%、0.87%、1.24%、1.02%和0.96%。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取通脈降糖膠囊樣品同一份供試品溶液(臨用新配)，于制備后0、2、4、6、10、12 h依法進(jìn)樣檢測，記錄毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、太子參環(huán)肽B、絞股藍(lán)皂苷XLIX、絞股藍(lán)皂苷A和絞股藍(lán)皂苷ⅩⅦ的峰面積。結(jié)果通脈降糖膠囊供試品溶液12 h內(nèi)穩(wěn)定，7個待測目標(biāo)成分峰面積的RSD分別為1.19%、1.25%、1.03%、1.40%、0.98%、0.72%和0.57%。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取同一批次已知含量的通脈降糖膠囊樣品適量，傾出內(nèi)容物，混勻，取9份，每份1.0 g，隨機(jī)分成3組，精密稱定，按《中華人民共和國藥典》2015年版四部要求精密加入另行配制的混合對照品溶液(毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、太子參環(huán)肽B、絞股藍(lán)皂苷XLIX、絞股藍(lán)皂苷A和絞股藍(lán)皂苷ⅩⅦ質(zhì)量濃度分別為0.209、0.127、0.374、0.048、0.443、0.615、0.849 mg·mL-1)1.0 mL 3份、2.0 mL 3份、3.0 mL 3份，再按2.1.2項(xiàng)下方法制備加樣供試品溶液，依法進(jìn)樣測定，計算毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、太子參環(huán)肽B、絞股藍(lán)皂苷XLIX、絞股藍(lán)皂苷A和絞股藍(lán)皂苷ⅩⅦ的加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.8 樣品含量測定

取通脈降糖膠囊3批樣品適量，傾出內(nèi)容物，混勻，取2.0 g，精密稱定，按2.1.2項(xiàng)下方法每個批次平行制備通脈降糖膠囊供試品溶液3份，依法進(jìn)樣檢測毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、太子參環(huán)肽B、絞股藍(lán)皂苷XLIX、絞股藍(lán)皂苷A和絞股藍(lán)皂苷ⅩⅦ的峰面積，分別計算7個待測目標(biāo)成分的含量，結(jié)果見表3。

表1 通脈降糖膠囊中7種成分線性關(guān)系考察試驗(yàn)結(jié)果

表2 通脈降糖膠囊樣品中7種成分的加樣回收率(n=9)

續(xù)表2

表3 通脈降糖膠囊樣品中7種成分含量測定結(jié)果(n=3) mg·g-1

3 討論

3.1 待測目標(biāo)成分的選擇

通脈降糖膠囊由黃芪、太子參、絞股藍(lán)、丹參、黃連、葛根、山藥、蒼術(shù)、玄參、水蛭、冬葵果11味中藥組方而來，方中黃芪補(bǔ)氣固表、生津養(yǎng)血，玄參清熱涼血、滋陰散結(jié)，合為君藥；太子參益氣生津，葛根生津止渴，黃連清熱燥濕，蒼術(shù)燥濕健脾，水蛭破血通經(jīng)、逐瘀消癥，合為臣藥；絞股藍(lán)益氣養(yǎng)陰、清熱解毒，山藥生津益肺，丹參活血祛瘀、涼血消癰，合為佐藥；冬葵果清熱利尿，為使藥。諸藥合用，能益氣健脾、養(yǎng)陰清熱以治本，祛濕化痰、活血通絡(luò)以治標(biāo)，以達(dá)養(yǎng)陰清熱、清熱活血之功效。本文參考中藥質(zhì)量標(biāo)志物確認(rèn)原則，選取君藥黃芪所含代表性成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素，臣藥太子參所含主要有效成分太子參環(huán)肽B，佐藥絞股藍(lán)所含特征性成分絞股藍(lán)皂苷XLIX、絞股藍(lán)皂苷A和絞股藍(lán)皂苷ⅩⅦ為定量測定目標(biāo)成分，為全面評價通脈降糖膠囊產(chǎn)品質(zhì)量提供參考。

3.2 流動相的選擇

參考相關(guān)文獻(xiàn)，對乙腈-水[12-14]、乙腈-0.3%甲酸溶液[11，15-16]和乙腈-0.3%冰醋酸溶液[10]3個流動相體系進(jìn)行對比考察，結(jié)果表明以乙腈-0.3%甲酸溶液為流動相時，各色譜峰分離度較好，為使檢測的7種成分出峰時間更合理，峰形好，雜質(zhì)最少，采用梯度洗脫法對有機(jī)相乙腈和水相0.3%甲酸溶液比例進(jìn)行不斷調(diào)節(jié)和優(yōu)化，最終確定采用乙腈-0.3%甲酸溶液為流動相，按正文2.1項(xiàng)下的梯度洗脫程序?qū)ν}降糖膠囊中的7種成分進(jìn)行同時檢測。

3.3 通脈降糖膠囊供試品溶液制備方法的優(yōu)化

首先在超聲提取60 min的同一條件下，對不同提取溶劑(甲醇[10-16]、50%甲醇、乙醇、50%乙醇)進(jìn)行對比考察，以通脈降糖膠囊中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、太子參環(huán)肽B、絞股藍(lán)皂苷XLIX、絞股藍(lán)皂苷A和絞股藍(lán)皂苷ⅩⅦ的綜合提取率以及雜質(zhì)峰數(shù)量等為指標(biāo)，結(jié)果以甲醇為提取溶劑時，所測7種成分提取效果最佳，雜質(zhì)峰較少；進(jìn)而依次對提取方式(超聲提取[12-15]、加熱回流提取[10-11，16])、提取時間(15、30、60 min)進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)，最終確定采用甲醇超聲提取30 min作為通脈降糖膠囊供試品溶液的制備方法。

本文首次采用HPLC梯度洗脫法，對通脈降糖膠囊中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素、太子參環(huán)肽B、絞股藍(lán)皂苷XLIX、絞股藍(lán)皂苷A和絞股藍(lán)皂苷ⅩⅦ含量進(jìn)行同時測定，建立了通脈降糖膠囊多指標(biāo)質(zhì)量控制模式，所建立的方法操作便捷、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高、專屬性強(qiáng)，為提升通脈降糖膠囊的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供了有力的數(shù)據(jù)支持。