循環(huán)外泌體miRNA在胃癌臨床診療應(yīng)用中的研究進(jìn)展

黃之野 綜述 梁海濱， 陳 磊 審校

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院普外科，上海 200092）

胃癌是常見的惡性腫瘤，位居全球惡性腫瘤發(fā)病率第4位、癌癥相關(guān)死亡第2位[1]。胃癌病人預(yù)后不良主要原因是確診時已為晚期、化療效果不理想等[2]。胃鏡病理學(xué)檢查是目前胃癌診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但侵入性的缺點(diǎn)限制其作為胃癌篩查手段[3]。目前有許多非侵入性檢測方法可用于胃癌診斷，如血清腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原 （carcinoembryonic antigen,CEA）、糖類抗原 199（carbohydrate antigen 199,CA199）、血清胃蛋白酶原等。但這些標(biāo)志物特異度和靈敏度不高，胃癌早期診斷的應(yīng)用受到限制[4]。因此，尋找特異度及靈敏度高的血清標(biāo)志物是目前胃癌早期診斷的研究熱點(diǎn)?；熓沁M(jìn)展期胃癌重要的治療方式，但病人存在對化療藥物原發(fā)或繼發(fā)的耐藥性，因此對胃癌病人化療耐藥性的監(jiān)測至關(guān)重要。

液態(tài)活檢是檢測病人外周循環(huán)體液，包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulation tumor cell，CTC）、血漿游離 DNA 和外周循環(huán)外泌體等[5]。外泌體是細(xì)胞分泌的雙層膜性囊泡小體，包含蛋白質(zhì)、信使 RNA（messenger RNA，mRNA）、微小 RNA（microRNA，miRNA）等多種生物活性分子，直徑30～100 nm。外泌體是由內(nèi)膜內(nèi)吞形成的細(xì)胞內(nèi)多囊泡體，后者與細(xì)胞膜融合后向胞外釋放多個腔內(nèi)囊泡[6]。幾乎所有人體細(xì)胞都能分泌外泌體，并廣泛存在于各種體液中。相比于正常細(xì)胞，惡性腫瘤細(xì)胞可分泌更多外泌體并釋放入血。外泌體在形成過程中會選擇性地裝載miRNA等物質(zhì)。多項(xiàng)研究表明，外周循環(huán)外泌體中富含腫瘤特異性miRNA，其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥過程中起重要作用。循環(huán)外泌體miRNA檢測在胃癌臨床診療應(yīng)用中潛力巨大[7]。本文就近年循環(huán)外泌體miRNA在胃癌早期診斷、預(yù)后評估及化療耐藥性檢測中的臨床應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。

循環(huán)miRNA的生物學(xué)特性及來源

miRNA是一類內(nèi)源性短鏈非編碼RNA，長度18～25個核糖核苷酸。miRNA分子通過與靶mRNA的3′段非編碼區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，使靶mRNA降解或沉默，從而抑制蛋白質(zhì)的合成，是轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵分子[8]。2008年，Mitchell等[9]首次在人體外周血中發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定存在的miRNA，且發(fā)現(xiàn)循環(huán)miRNA具有作為前列腺癌標(biāo)志物的潛力。近年來循環(huán)miRNA作為各類疾病標(biāo)志物的研究備受關(guān)注。

循環(huán)miRNA的來源、產(chǎn)生機(jī)制，以及穩(wěn)定存在于血液中的機(jī)制一直是研究熱點(diǎn)。綜合已有的研究分析，循環(huán)miRNA的來源主要有以下途徑：①活細(xì)胞的主動分泌。包括以外泌體、微泡或與AGO蛋白2（argonaute protein 2）核糖蛋白結(jié)合形成復(fù)合體的形式分泌并穩(wěn)定存在[10]。Arroyo等[10]研究表明，核糖體AGO蛋白2復(fù)合體是循環(huán)miRNA的主要存在形式，然而也有研究表明，血清中的miRNA更多存在于外泌體中[11]。②壞死或凋亡細(xì)胞的被動分泌[12]。原位腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死時會釋放出胞質(zhì)內(nèi)的miRNA等物質(zhì)入血，形成循環(huán)游離 miRNA（circulation free RNA，cfRNA）。 此外，腫瘤細(xì)胞通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換過程侵入血管內(nèi)皮從而進(jìn)入血液循環(huán)，即CTC。CTC入血后存活時間短，隨后發(fā)生溶胞作用，釋放出miRNA等物質(zhì)，從而形成cfRNA[12]。

目前檢測循環(huán)miRNA的常用方法包括微陣列芯片、RNA測序、Northern印跡雜交和定量 RT-PCR（quantitative RT-PCR，qRT-PCR），但這些方法并不能區(qū)分循環(huán)miRNA的來源。相比其他來源的循環(huán)miRNA，循環(huán)外泌體miRNA更有優(yōu)勢。研究表明，外泌體在形成過程中會選擇性地裝載miRNA等物質(zhì)。不同腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體中包含不同比例、不同種類的miRNA。外泌體可通過與受體細(xì)胞膜融合，轉(zhuǎn)運(yùn)其攜帶的生物活性物質(zhì)，介導(dǎo)細(xì)胞間的信號交流與物質(zhì)傳遞，調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移、侵襲耐藥等行為[7]。同時外泌體miRNA檢測可在腫瘤細(xì)胞凋亡和壞死之前進(jìn)行。因此，循環(huán)外泌體miRNA檢測更適合應(yīng)用于臨床腫瘤的早期診斷和預(yù)后評估[13-14]。

循環(huán)外泌體miRNA作為胃癌診斷的標(biāo)志物

胃癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，不易發(fā)現(xiàn)，進(jìn)展期易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。胃癌防治的關(guān)鍵在于能否早診斷早治療[2]。多項(xiàng)研究表明，循環(huán)外泌體miRNA有潛力成為胃癌診斷新型標(biāo)志物。

慢性萎縮性胃炎被視為胃癌癌前病變。Liu等[15]研究表明，循環(huán)外泌體miRNA可作為慢性萎縮性胃炎的無創(chuàng)性診斷方法。該研究采用二代測序分析，比較30例慢性萎縮性胃炎與30例慢性非萎縮性胃炎病人血清外泌體miRNA表達(dá)譜，篩選出10個有表達(dá)差異的候選miRNA，并通過qRTPCR進(jìn)一步驗(yàn)證這60例病人。最終發(fā)現(xiàn)血清外泌體hasmiR-122-5p在慢性萎縮性胃炎病人中顯著高表達(dá)。繪制受試者工作特征 （receiver operating characteristic，ROC）曲線后，求得ROC曲線下面積 （area under curve，AUC）值為0.67，特異度86%，靈敏度62%。這些結(jié)果表明血清外泌體has-miR-122-5p有望成為診斷GC癌前病變的新型標(biāo)志物。

也有學(xué)者嘗試將循環(huán)外泌體miRNA作為胃癌診斷標(biāo)志物。Shi等[16]綜合分析兩個高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫后，發(fā)現(xiàn)6個候選循環(huán)miRNA在胃癌病人中高表達(dá)，通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)循環(huán)miR-1246表達(dá)差異性最大。體外實(shí)驗(yàn)表明，腫瘤來源的miR-1246在胚胎致死異常視覺樣蛋白1（embryonic lethal abnormal vision like 1,ELAVL1）的幫助下以外泌體的形式存在于循環(huán)中。在包含85例胃癌和50例健康人群的血液樣本中檢測其診斷效能，其AUC為0.91，特異度86%，靈敏度82%。進(jìn)一步檢測28例TNMⅠ期胃癌、50例健康人和30例胃良性疾病病人的血液樣本，發(fā)現(xiàn)循環(huán)外泌體miR-1246表達(dá)水平可區(qū)分TNMⅠ期胃癌病人與非胃癌人群（健康對照和胃良性疾?。?，其AUC值分別為0.84（特異度74%，靈敏度85%）和0.81（特異度80%，靈敏度78%）。Yang等[17]使用qRT-PCR檢測80例胃癌病人和80例健康人群血清中4個候選外泌體miRNA的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外泌體miR-423-5p在胃癌病人的血清中顯著高表達(dá)。為更好地探究該miRNA的臨床價值，進(jìn)一步比較循環(huán)外泌體miR-423-5p與常見的血清腫瘤標(biāo)志物CEA和CA199的診斷價值。結(jié)果表明，循環(huán)外泌體miR-423-5p、CEA和CA199的AUC值分別為 0.76（特異度 57%，靈敏度 81%）、0.60和 0.61（后兩個均未給出特異度和靈敏度），miR-423-5p具有較高的診斷效能。另外還報道，循環(huán)外泌體 miR-135b[18]、miR-23b[19]、miR-107[20]、miR-1290[21]、miR-451[22]也具有成為胃癌診斷生物標(biāo)志物的潛在價值。

然而，考慮到單個miRNA可調(diào)控多個基因表達(dá)，同時也可能參與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展，因此，采用單個miRNA診斷胃癌的特異性欠佳，可能聯(lián)合多個miRNA作為診斷標(biāo)志物效能較好。Wang等[23]首先在20例胃癌病人和20例健康人血清樣本中采用qRT-PCR篩選出4種差異性表達(dá)的循環(huán)外泌體miRNA。隨后在90例胃癌病人和90例健康人血清樣本，獲得2個有意義的循環(huán)外泌體miRNA（miR-19b和miR-106a），單獨(dú)診斷的AUC值分別為0.79和0.77，兩者聯(lián)合診斷的AUC值達(dá)到0.81（但未給出特異度和靈敏度）。為進(jìn)一步檢驗(yàn)其診斷價值，Wang等[23]對這2種miRNA進(jìn)行雙盲檢測，在20例胃癌病人和20例健康人血清樣本的驗(yàn)證中，循環(huán)外泌體miR-19b和miR-106a聯(lián)合診斷正確區(qū)分胃癌19例（靈敏度95%），健康人 18例（特異度 90%）。Huang等[24]用相似的研究方法鑒定發(fā)現(xiàn)6種miRNA在病人血清中高表達(dá)， 其中 4 種 miRNA（miR10b-5p、miR195-5p、miR20a-3p、miR296-5p）主要以外泌體的形式存在于外周血。盡管單獨(dú)診斷的AUC不高，6種血清miRNA聯(lián)合檢測的AUC達(dá)到0.70（均未給出特異度和靈敏度），但未評估4種外泌體miRNA聯(lián)合檢測診斷效能。

綜合現(xiàn)有報道，目前對于循環(huán)外泌體miRNA應(yīng)用于胃癌早期診斷的研究仍較少，在研究方法（如未與金標(biāo)準(zhǔn)胃鏡活檢病理學(xué)診斷進(jìn)行盲法比較，未設(shè)置對照，未確認(rèn)正常值等）和病例選擇（數(shù)量少且缺乏代表性）等方面仍有缺陷，說明循環(huán)外泌體miRNA與臨床應(yīng)用尚有很大距離。此外，多種細(xì)胞在正常生理或病理狀態(tài)下均能分泌外泌體，如何區(qū)分生理性和病理性外泌體以及判斷是否為腫瘤來源的外泌體仍需要更多研究。因此，循環(huán)外泌體miRNA只能作為胃癌早期診斷輔助指標(biāo)或與其他無創(chuàng)檢測指標(biāo)聯(lián)合提高診斷效能。但因其方便、可重復(fù)、高特異性的優(yōu)勢，循環(huán)外泌體miRNA作為胃癌早期診斷的新型生物標(biāo)志物仍具有研究價值。

循環(huán)外泌體miRNA在評估胃癌預(yù)后中的價值

最近，越來越多的研究已證實(shí)，循環(huán)外泌體miRNA與胃癌治療效果和預(yù)后、復(fù)發(fā)有關(guān)聯(lián)性。Kumata等[19]研究表明，循環(huán)外泌體miR-23b可作為評估胃癌病人各腫瘤分期預(yù)后的獨(dú)立危險因素，且可一定程度預(yù)測胃癌病人術(shù)后復(fù)發(fā)。Kumata等[19]通過基因芯片技術(shù)檢測3例胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)病人、3例胃癌術(shù)后未復(fù)發(fā)病人和3例健康人血清樣本，發(fā)現(xiàn)胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)病人外泌體miR-23b顯著低表達(dá)。進(jìn)一步研究將232例不同腫瘤分期胃癌病人分為外泌體miR-23b高表達(dá)與低表達(dá)兩組，發(fā)現(xiàn)外泌體miR-23b表達(dá)與腫瘤大小、侵襲度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移以及TNM分期之間存在關(guān)聯(lián)。在預(yù)后方面，研究者分析病人各腫瘤分期的總生存（overall survival，OS）及無病生存（disease-free survival，DFS）。 單變量及多變量分析顯示，循環(huán)外泌體miR-23b低表達(dá)在各腫瘤分期中都是預(yù)后不良的獨(dú)立危險因素。

另一項(xiàng)研究證實(shí)循環(huán)外泌體miR-451可預(yù)測胃癌病人預(yù)后[22]，且驗(yàn)證循環(huán)外泌體miR-451來自于胃癌組織。Liu等[22]檢測76例胃癌病人的癌組織、癌旁組織和循環(huán)外泌體，發(fā)現(xiàn)miR-451在癌組織中顯著低表達(dá)，在癌旁組織浸潤的T細(xì)胞和循環(huán)外泌體中顯著高表達(dá)。隨后將胃癌病人分為循環(huán)外泌體miR-451高表達(dá)組和低表達(dá)組，并分別繪制生存曲線，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)組預(yù)后顯著較差，5年生存率為15.90%[風(fēng)險比（hazard ratio,HR）=4.34]。進(jìn)一步線性相關(guān)分析表明，癌組織miR-451表達(dá)水平與腫瘤浸潤T細(xì)胞中表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，循環(huán)外泌體miR-451表達(dá)水平與腫瘤浸潤T細(xì)胞中表達(dá)水平呈正相關(guān)，從而提出腫瘤可能通過外泌體的形式向腫瘤周圍組織和外周血分泌miR-451，誘導(dǎo)腫瘤浸潤輔助性T細(xì)胞17（T helper cell 17,Th17）分化，從而在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。

Bai等[18]研究表明，胃癌細(xì)胞分泌的外泌體miR-135b通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞叉頭蛋白家族O亞群蛋白1（forkhead boxcontaining protein,O subfamily1,FoxO1）的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤周圍血管生成。該研究通過檢測3 951例GC組織中FoxO1 mRNA水平并繪制生存曲線，發(fā)現(xiàn)FoxO1 mRNA低表達(dá)的胃癌病人總體生存率明顯下降。運(yùn)用生物信息分析工具篩選出FoxO1上游的潛在調(diào)節(jié)miRNA，結(jié)合病人癌組織及循環(huán)外泌體中miR-135b均高表達(dá)，最終確定外泌體miR-135b可通過調(diào)控FoxO1表達(dá)影響胃癌預(yù)后。然而循環(huán)外泌體miR-135b可否作為病人預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)仍待進(jìn)一步研究。

另外，還有多項(xiàng)研究指出，胃癌病人循環(huán)外泌體miRNA表 達(dá) 水 平 與 淋 巴 結(jié) 轉(zhuǎn) 移 （miR-423-5p[17]、miR-19b[23]、miR-106a[23]）、TNM 分 期 （miR-19b[23]、miR-106a[23]、miR-1246[16]、miR-221[25]）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（miR-1246[16]）等影響預(yù)后的因素有關(guān)聯(lián)。然而目前關(guān)于循環(huán)外泌體miRNA在胃癌預(yù)后預(yù)測方面的研究有缺陷。其所選定病人處于不同病程階段，隨訪時間不充足，結(jié)局未采用盲法，未進(jìn)行校驗(yàn)等。因此還需進(jìn)一步研究。以上研究結(jié)果表明，循環(huán)外泌體miRNA具有預(yù)測胃癌預(yù)后的潛力。

循環(huán)外泌體miRNA評估胃癌化療敏感性

目前也有關(guān)于循環(huán)外泌體miRNA預(yù)測胃癌化療敏感性的研究。魏瑋等[26]采用二代測序?qū)?例以氟尿嘧啶為基礎(chǔ)化療的耐藥胃癌病人血清進(jìn)行檢測，比較病人化療前及耐藥后的血清外泌體miRNA表達(dá)水平，篩選出上百個具有顯著表達(dá)差異的miRNA，提出以下可能性。通過晚期胃癌血清外泌體miRNA表達(dá)的檢測預(yù)測和實(shí)時監(jiān)測化療耐藥性，并對相應(yīng)靶基因進(jìn)行干預(yù)。Zheng等[27]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞來源的外泌體可將miR-21轉(zhuǎn)運(yùn)至胃癌細(xì)胞中，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞對順鉑產(chǎn)生耐藥。盡管循環(huán)miR-21作為胃癌診斷標(biāo)志物早有報道[28]，但循環(huán)外泌體miR-21能否用于臨床檢測胃癌病人化療耐藥性仍需進(jìn)一步探索。Wang等[29]采用qRT-PCR檢測順鉑耐藥胃癌細(xì)胞系中miR-214表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞miR-214顯著高表達(dá)。在此基礎(chǔ)上制備出含有抗miR-214的外泌體，在分子、細(xì)胞和動物水平上驗(yàn)證含有抗miR-214的外泌體可逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性，為難治性胃癌提供潛在替代方案。這些研究說明循環(huán)外泌體miRNA在化療敏感性預(yù)測和實(shí)時監(jiān)測方面具有巨大潛力，但同樣存在研究例數(shù)較少、缺乏驗(yàn)證等缺陷，需進(jìn)一步努力研究。

綜上所述，循環(huán)外泌體miRNA在胃癌的早期診斷、預(yù)后評估及化療耐藥性監(jiān)測中具有潛在應(yīng)用價值（見表1）。

思考與展望

循環(huán)外泌體miRNA檢測便捷、創(chuàng)傷小、可重復(fù)、穩(wěn)定性高的優(yōu)勢使其臨床意義顯著。外泌體作為細(xì)胞間交流的重要物質(zhì)，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移、化療耐藥等生物學(xué)過程密切相關(guān)。因此，循環(huán)外泌體miRNA在胃癌早期診斷，預(yù)后評估、化療監(jiān)測、作為基因治療靶向載體等方面均有良好的臨床應(yīng)用前景。

表1 循環(huán)外泌體miRNA在胃癌臨床診斷、預(yù)后、化療耐藥性中的研究

然而目前關(guān)于循環(huán)外泌體miRNA的臨床應(yīng)用仍存在諸多不足，如目前針對胃癌循環(huán)外泌體miRNA的檢測例數(shù)和納入研究范圍仍有缺陷。在不同發(fā)病階段、不同胃癌病理分型、不同分期、手術(shù)前后及化療前后，胃癌病人循環(huán)外泌體miRNA量與質(zhì)的變化規(guī)律等方面仍需進(jìn)一步臨床研究。目前發(fā)現(xiàn)的存在表達(dá)差異的循環(huán)外泌體miRNA缺少針對腫瘤的特異性，一種miRNA在多種腫瘤中都有表達(dá)，僅檢測一種miRNA，其特異度和靈敏度不高。聯(lián)合多個miRNA甚至其他腫瘤指標(biāo)可大大提高診斷價值，可能是今后研究方向。循環(huán)外泌體miRNA含量較少，檢測難度較大，檢測成本較高，尋找成本適中且成熟可靠的循環(huán)外泌體miRNA檢測技術(shù)，提高其應(yīng)用于臨床的可行性，仍需探討。目前關(guān)于外泌體miRNA的基礎(chǔ)研究較多，將基礎(chǔ)研究成果轉(zhuǎn)化成真正的診療手段還有待進(jìn)一步探索。隨著基礎(chǔ)理論與臨床應(yīng)用研究的不斷深入和發(fā)展，循環(huán)外泌體miRNA應(yīng)用于癌癥診治的價值終將實(shí)現(xiàn)。