酶改性大豆種皮多糖對蛋白乳液穩(wěn)定性的影響

王勝男，趙賀開，邵國強，王冰冶，曲丹妮，劉思怡，何余堂，劉賀

(渤海大學 食品科學與工程學院，遼寧 錦州，121013)

大豆種皮是大豆產(chǎn)品加工過程中主要的副產(chǎn)物，約占大豆質量的6%～8%[1]，具有廉價、果膠和纖維素含量高等特點，常被作為提取多糖及過氧化酶等物質的原料[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，大豆種皮多糖(soy hull polysaccharide,SHP)具有良好的功能特性和生物活性[3],其功能特性及生物活性依賴于化學結構，利用改性修飾的方法可以提高其功能特性，拓寬應用領域[3-4]。果膠類多糖的修飾主要包括物理法、化學法、酶解法等。BIZMAEK等[5-6]研究發(fā)現(xiàn)，乙基化的纖維素納米顆粒能夠在幾秒內(nèi)吸附至油水界面并顯著降低表面張力，能有效穩(wěn)定水包油型皮克林乳液。王勝男等[7]發(fā)現(xiàn)，微波輔助草酸銨法提取的SHP比熱水提取法具有較好的乳化性能。酶解法具有特異性高、反應條件溫和等優(yōu)點，被廣泛應用于多糖修飾。KIM等[8]用α-淀粉酶和淀粉葡糖苷酶酶解紅參粗多糖，發(fā)現(xiàn)酶解后多糖對腸道免疫系統(tǒng)和巨噬細胞活性有明顯增強作用。SHP主要由半乳糖醛酸、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和部分蛋白質構成[9]，利用酶解法對多糖鏈段進行斷裂或修飾蛋白部分可改變多糖結構及功能特性。因此，本文利用β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶和木瓜蛋白酶對SHP進行酶解處理，通過基本成分、傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared,FT-IR)分析，原子力顯微鏡(atomic force microscopy,AFM)對酶解后多糖進行表征，通過粒徑、Zeta電位、乳化活性、乳化穩(wěn)定性及多重光散射分析不同酶酶解前后多糖結構及對乳化性能，為酶解法改性多糖提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆皮,遼寧錦州大豆皮經(jīng)銷公司；β-半乳糖苷酶(10 000 U/g),上海普育科貿(mào)有限公司;β-葡聚糖酶(10 000 U/g),山東安克生物工程有限公司;木瓜蛋白酶(10 000 U/g),上海麥克林生化科技有限公司；草酸銨、無水乙醇、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS),均為分析純。

1.2 儀器與設備

FW-100型高速萬能粉碎機，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；馬弗爐，上海特成機械設備有限公司；8L-320S型電子天平、UV-2550型紫外分光光度儀，日本島津公司；RE-3000型旋轉蒸發(fā)器，上海亞萊生化儀器廠；BT-9300ST型激光粒度分布儀，丹東市百特儀器有限公司；Nano-ZS90型激光粒度儀，英國馬爾文公司；XE-70原子力顯微鏡，韓國Park Systems公司；L535R型臺式低速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；90 Plus型Zeta電位儀，美國布魯克海文儀器公司；DHR-1型流變儀，美國TA公司；Scitar 2000型傅里葉紅外儀，美國安捷倫科技有限公司；JB-2A恒溫磁力攪拌器，上海雷磁儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 SHP的提取

大豆種皮過篩，將其中豆瓣碎渣除去后，粉碎過60目篩。取大豆種皮200 g于燒杯中，按料液比1∶10(g∶mL)加入1%(體積分數(shù))的乙醇溶液，室溫下攪拌30 min，靜置后用200目雙層紗布過濾，將濾渣放置于65 ℃的鼓風干燥箱中烘干。準確稱取烘干后的大豆種皮殘渣100 g，按料液比1∶20(g∶mL)加入質量濃度6 g/L的草酸銨，再加入95～100 ℃的蒸餾水，在微波85 ℃條件下處理20 min，冷卻靜置后，200目雙層紗布過濾后在3 500 r/min的條件下離心15 min[10]。取上清液蒸發(fā)濃縮至原體積的1/3，用0.01 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至4.0，緩慢加入雙倍體積的無水乙醇，用玻璃棒進行攪拌，直至多糖完全析出，放置40 min后過濾，將濾渣于65 ℃恒溫干燥箱中烘干，即可得到SHP。

1.3.2 酶解SHP的制備

稱取15.00 g SHP，加入0.10 g β-半乳糖苷酶，調(diào)節(jié)pH至6.7，在水浴鍋中恒溫39 ℃,酶解2 h。酶解后95 ℃加熱10 min滅酶活力，再將其倒入干凈托盤中，放置于65 ℃烘箱中烘干，得到β-半乳糖苷酶酶解的多糖(SHP modified by β-galactosidase,GAL)[11]。

稱取15.00 g SHP，加入0.10 g β-葡聚糖酶，調(diào)節(jié)pH至7.5，在水浴鍋中恒溫45 ℃,酶解1.5 h。酶解后95 ℃加熱10 min滅酶活力，再將其倒入干凈托盤中，放置于65 ℃烘箱中烘干，得到β-葡聚糖酶酶解的多糖(SHP modified by β-glucanase,GLU)。

稱取10.00 g SHP，根據(jù)木瓜蛋白酶的酶活力，加入0.115 g木瓜蛋白酶，調(diào)節(jié)pH至6.0，在水浴鍋中恒溫50 ℃,酶解1 h。酶解后95 ℃加熱10 min滅酶活力，再將其倒入干凈托盤中，放置于65 ℃烘箱中烘干，得到木瓜蛋白酶酶解的多糖(SHP modified by papain,PAP)[12]。

1.3.3 基本成分測定

總糖含量：采用苯酚-H2SO4法測定[13]；

蛋白質含量：采用酶標儀法利用BCA試劑盒測定；

水分含量：參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》進行測定；

灰分含量：參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》利用分析天平進行測定；

糖醛酸含量：采用H2SO4-咔唑比色法進行測定[14]。

1.3.4 FT-IR測定

采用壓片法，將樣品與KBr按質量比為1∶100混合充分研磨，利用模具與壓片機將粉末制成壓片。在樣品測定之前先進行背景掃描去除干擾因素，在400～4 000 cm-1進行紅外光譜掃描。

1.3.5 AFM測定

將SHP、GAL、GLU、PAP分別配制成質量濃度5 mg/mL，取5 μL樣品溶液置于新剝離云母片表面，自然干燥后利用AFM測量。

1.3.6 乳液的制備

將大豆分離蛋白(soy protein isolate，SPI)配制成4%(質量分數(shù))水溶液，取80 mL與20 mL大豆油混合，在8 000 r/min的高速分散均質機下剪切2 min，得到初級乳狀液。再將SHP、GAL、GLU、PAP分別配制成0.8%(質量分數(shù))水溶液100 mL，并進行磁力攪拌使其充分溶解后，與初級乳狀液混合，利用高速分散均質機在8 000 r/min下剪切2 min進行粗均質，再使用高壓均質機在50 MPa下均質3 min，最終使乳狀液包含2%(質量分數(shù))SPI、10%(體積分數(shù))油和0.4%(質量分數(shù))酶解大豆種皮多糖。再加入0.2%(質量分數(shù))疊氮化鈉抑制微生物的生長，并將制得的乳狀液在4 ℃下避光保存。以未添加多糖，添加2%(質量分數(shù))大豆分離蛋白乳狀液(SPI emulsion,SPIE)為對照組，其余4組添加不同多糖配制的乳狀液簡寫為β-半乳糖苷酶酶解多糖乳液(GAL emulsion，GALE)、β-葡聚糖酶酶解多糖乳液(GLU emulsion，GLUE)、木瓜蛋白酶(PAP emulsion，PAPE)和大豆種皮多糖乳液(SHP emulsion，SHPE)。

1.3.7 乳化活性和乳化穩(wěn)定性的測定

乳化性的測定參考MOLINA等[15]的方法，將大豆多糖-大豆分離蛋白復合乳液用質量濃度1 g/L SDS溶液稀釋1 000倍。在波長500 nm條件下，用紫外分光光度計測定吸光值A0，計算乳化活性指數(shù)(emulsifying activity index,EAI)。靜置30 min后測定吸光值A30，計算乳化穩(wěn)定性(emulsiflying stability index,ESI)。

1.3.8 乳液粒徑分布與Zeta電位的測定

利用BT-9300ST激光粒度分布儀測定乳狀液的粒度分布情況，測定前需攪拌溶液，使其溶液內(nèi)分子分布均勻，并記錄中位徑(D50)、表面積分數(shù)平均粒徑(D3,2)及體積分數(shù)平均粒徑(D4,3)[16]。利用NANO ZS90激光粒度分布儀在室溫下測定乳狀液Zeta電位。

1.3.9 流變性質的測定

采用DHR-1流變儀測定，取1.5 mL乳狀液加在測試臺上，狹縫距離設置為0.5 mm，剪切速率0～100 s-1，檢測樣品流變特性。

1.3.10 多重光散射的測定

將20 mL樣品裝進樣品瓶，確保沒有氣泡，多重光散射儀掃描，1 min掃描1次，掃描30 min。

1.3.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0軟件進行差異顯著性分析，檢驗標準，P<0.05。采用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 酶解大豆種皮多糖組成成分及結構

酶解后大豆種皮多糖組成成分見表1。β-半乳糖苷酶水解β-半乳糖苷鍵，β-葡聚糖酶水解β-1,3和β-1,4糖苷鍵，而木瓜蛋白酶可以水解蛋白質。4種多糖的總糖含量差異不顯著(P>0.05)，GAL總糖含量最高為(46.96±8.36)%。3種酶解多糖的糖醛酸含量差異顯著(P<0.05)，GAL與GLU糖醛酸含量顯著增加(P<0.05)，原因可能為2種酶將SHP分解為小分子低聚糖；而PAP糖醛酸含量顯著降低(P<0.05)，可能是木瓜蛋白酶將多糖中蛋白質分解為小分子多肽，引起多肽和糖醛酸間相互作用。酶解后的多糖水分含量較SHP高，可能是多糖經(jīng)酶解后吸濕性發(fā)生改變。

表1 基本組成成分 單位：%

圖1 四種大豆種皮多糖的傅里葉紅外光譜圖Fig.1 FT-IR of four soy hull polysaccharides

2.2 AFM分析

SHP、GAL、GLU和PAP的AFM圖見圖2。由圖2可知，4種多糖在云母片上形成不均勻的薄膜，由塊狀多糖聚集體與顆粒組成。GAL(圖2-a)與GLU(圖2-b)的聚集體尺寸比SHP小，小顆粒明顯增多，原因可能是GAL與GLU含有較多的糖醛酸，糖醛酸中羧基或羧基陰離子上強電負性氧原子與糖鏈中氫原子形成氫鍵所致[20]。由圖2-a可知，GAL擁有較多的糖鏈分支結構而導致多糖聚集體較其他多糖多，可能造成多糖支鏈靈活性降低進而影響多糖乳化性能。PAP(圖2-c)聚集體較大，原因可能是較大的電負性與帶負電荷云母之間產(chǎn)生較大排斥力所致。

a-GAL;b-GLU;c-PAP;d-SHP圖2 四種大豆種皮多糖的原子力顯微鏡圖Fig.2 Atomic force microscope of four soy hull polysaccharides

2.3 乳液粒徑分布與Zeta電位

5種乳液的平均粒徑及粒徑分布如表2和圖3所示。由表2可知，與SHPE、SPIE相比，GALE與GLUE平均粒徑均顯著減小(P<0.05)，PAPE則無顯著差別(P>0.05)，說明GAL和GLU所形成的蛋白乳狀液較穩(wěn)定。結合圖3可知，GALE、PAPE、SHPE和SPIE均呈現(xiàn)單峰，為單分散體系，而GLUE呈現(xiàn)雙峰分布，為多分散體系。GALE和GLUE液滴均朝粒徑變小方向移動，峰值高且分布集中，乳化液穩(wěn)定性較好，而PAPE、SHPE、SPIE粒徑分布基本一致，峰值低且粒徑分布范圍較寬，粒徑較大液滴占主要部分，可見GALE和GLUE乳化能力較強。

由表2可知，5種乳液均帶負電荷，GALE與GLUE電位絕對值較小，分別為(-2.40±0.44)和(-2.88±0.60)mV，液滴之間的斥力較小，乳狀液的穩(wěn)定性較差，PAPE電位變化明顯[(-29.1±2.59)mV]且電位絕對值最大(P<0.05)，液滴之間的斥力較大不易聚集，乳狀液穩(wěn)定性好。這種現(xiàn)象可能由于木瓜蛋白酶對SHP中蛋白質酶解作用，多糖中帶負電荷基團的暴露和帶正電荷蛋白質的酶解從而引起PAPE電位顯著變化。SHP在油水界面與SPI發(fā)生微弱相互作用導致GALE、GLUE、SHPE電位絕對值較SPIE有所降低。

表2 乳狀液粒徑、Zeta電位、乳化活性及乳化穩(wěn)定性Table 2 Particle size,Zeta potential,emulsifying active and emulsifying stability value of emulsion

圖3 乳狀液粒徑分布圖Fig.3 Normal distribution of emulsion particle size

2.4 乳液乳化活性及乳化穩(wěn)定性

乳化活性和乳化穩(wěn)定性是直接反映乳狀液特性的重要指標。5種乳液的EAI和ESI如表2所示。SPIE乳化穩(wěn)定性最差,其ESI值為2 186.34 min，添加4種多糖后GALE的EAI及ESI值變化最小，分別為31.27 m2/g 和2 482.05 min，而GLUE乳化活性及乳化穩(wěn)定性最好，分別為39.72 m2/g和4 198.11 min。原因可能是GAL的總糖和蛋白質含量最高，液滴表面蛋白質多糖復合保護層較其他3種乳狀液厚，隨時間延長不易破損，所以提高了乳化活性與乳化穩(wěn)定性。SHP中半乳糖含量占27.26%并含有聚半乳糖，經(jīng)β-半乳糖苷酶酶解后斷裂了β-半乳糖苷鍵形成了較多的低聚糖，導致GALE乳化活性及乳化穩(wěn)定性均較低。

2.5 乳液流變性性質

圖4-a和圖4-b分別表示剪切速率對剪切應力和黏度的影響。由圖4-a可知，隨剪切速率的增加乳狀液剪切應力依次增大，其中PAPE的剪切應力最大，其次是SHPE、GALE、GLUE和SPIE。5種乳液剪切速率0.1～100 s-1間均呈現(xiàn)剪切變稀現(xiàn)象，PAPE變化顯著說明多糖促進乳液抗絮凝作用較好。由圖4-b可知，GALE，GLUE和SPIE黏度變化較小，結合2.3與2.4分析可知，GALE粒徑小、分布窄造成黏度變化緩慢，而GLUE與SPIE由于乳化穩(wěn)定性較好，單個液滴不易分散成小液滴導致黏度下降遲緩。

a-剪切應力;b-黏度圖4 乳液的流變學性質Fig.4 Rheology property of emulsions

2.6 多重光散射

乳狀液在放置過程中，液滴在重力和布朗運動作用下相互碰撞，導致出現(xiàn)分層、絮凝、聚集等失穩(wěn)現(xiàn)象。多重光散射技術可以對流體穩(wěn)定性做出快速、有效的評價[21]。圖5為5種乳液在14 d Turbiscan穩(wěn)定性指數(shù)(turbiscan stability index,TSI)的變化趨勢圖，TSI 穩(wěn)定系數(shù)越小、斜率越小，表明乳液越穩(wěn)定。如圖5所示，初始乳液在掃描時間30 min內(nèi)TSI值均在0.5左右，說明初始乳狀液穩(wěn)定性能較好。隨貯藏時間的延長，儲存7 d后 SPIE的TSI值增大，而多糖乳狀液的TSI值變化不大，但SHPE乳液穩(wěn)定性較GLUE與GALE差。儲存14 d后SPIE出現(xiàn)分層現(xiàn)象，未測定TSI值。添加酶改性多糖乳狀液中PAPE的TSI值在30 min內(nèi)增至0.72，GALE、GLUE和SHPE的TSI值略有升高但最終保持在0.5左右，SHPE在0～10 min上升趨勢較GLUE和GALE快，穩(wěn)定性略差。

a-初始樣品；b-7 d樣品；c-14 d樣品圖5 貯藏時間對TSI的影響Fig.5 The influence of storage time on TSI

3 結論

本研究采用β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、木瓜蛋白酶處理SHP，發(fā)現(xiàn)酶改性后多糖的組成、結構、分子鏈形貌差異顯著，其中PAP的結構變化較大。研究發(fā)現(xiàn)，酶改性多糖的乳化能力均提高。同時，添加不同酶改性可以提高乳液的穩(wěn)定性，其中GALE與GLUE粒徑較小且分布均勻，同時黏度與剪切應力隨剪切速率增大變化較小，TSI值隨貯藏時間的延長變化不大，證明經(jīng)β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶處理的SHP可有效增強乳液穩(wěn)定性。因此，可利用β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶改性提高SHP的乳化能力。