改造非磷酸轉(zhuǎn)移酶葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑強(qiáng)化解淀粉芽胞桿菌合成L-酪氨酸

季安營(yíng)，魏雪團(tuán)

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢，430070)

L-酪氨酸(L-tyrosine，Tyr)是人和動(dòng)物體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)必需氨基酸[1]，廣泛用于食品、飼料添加劑及醫(yī)藥原料等[2-4]。L-酪氨酸可通過(guò)多種微生物發(fā)酵合成，其中大腸桿菌是目前研究較多的菌種，然而大腸桿菌系統(tǒng)不適于食品級(jí)酪氨酸的合成[5-12]。解淀粉芽胞桿菌因具有食用安全、易于培養(yǎng)、生長(zhǎng)快速等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[13-15]。KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，解淀粉芽胞桿菌中存在完整的L-酪氨酸合成途徑，這為解淀粉芽胞桿菌構(gòu)建L-酪氨酸高產(chǎn)菌株奠定了基礎(chǔ)。然而，目前還未見(jiàn)通過(guò)解淀粉芽胞桿菌合成L-酪氨酸的報(bào)道。

磷酸轉(zhuǎn)移酶葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是細(xì)菌吸收葡萄糖的主要途徑，然而該過(guò)程會(huì)消耗大量的磷酸烯醇式丙酮酸，不利于L-酪氨酸的合成。非磷酸轉(zhuǎn)移酶葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)一方面可平衡糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)之間的代謝流，另一方面可增加磷酸烯醇式丙酮酸的積累[16-17]，有利于L-酪氨酸的合成。本研究通過(guò)基因過(guò)表達(dá)技術(shù)構(gòu)建了系列解淀粉芽胞桿菌工程菌株，考察強(qiáng)化非磷酸轉(zhuǎn)移酶葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑基因?qū)獾矸垩堪麠U菌合成L-酪氨酸的影響，挖掘影響L-酪氨酸生物合成的關(guān)鍵基因，為解淀粉芽胞桿菌合成L-酪氨酸的代謝工程育種提供行之有效的策略。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

本研究所用到的菌株和質(zhì)粒如表1和表2所示。其中大腸桿菌DH5α用于構(gòu)建載體，HZΔptsH為本實(shí)驗(yàn)室保存缺失磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的解淀粉芽胞桿菌工程菌株。

表1 研究中使用的菌株Table 1 Strains used in this study

表2 研究中使用的質(zhì)粒Table 2 Plasmids used in this study

1.1.2 PCR引物

本研究所用的主要引物見(jiàn)表3。

表3 研究所使用的PCR引物Table 3 Primers used for PCR in this study

續(xù)表3

1.1.3 主要試劑

TransStartRFastPfu DNA聚合酶、TransStartReasyTaqDNA聚合酶：北京全式金公司；dNTPS、DNA限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DL5000 Marker：TaKaRa公司；DNA抽提試劑盒：武漢楚誠(chéng)正茂科技工程有限公司；DNA回收試劑盒和質(zhì)粒抽提試劑盒：美國(guó) OmegaBio-Tek公司；基因引物合成、測(cè)序：武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司；甲醇為色譜級(jí)，其他主要生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析級(jí)純。

1.1.4 主要培養(yǎng)基

Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母浸出粉5.0，氯化鈉10.0，固體培養(yǎng)基加1.5%～2%的瓊脂粉?？股嘏囵B(yǎng)基添加相應(yīng)抗生素,至終質(zhì)量濃度為20 μg/L。

L-酪氨酸初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖22，(NH4)2SO43，K2HPO46.75，KH2PO41.25，MgSO4·7H2O 1.5，檸檬酸鈉5，蛋白胨3，酵母提取物6。

微量元素(g/L)：檸檬酸鈉10，F(xiàn)eSO4·7H2O 4，CaC124，MnSO4·5H2O 1，CoCl2·6H2O 0.4，ZnSO4·7H2O 0.2，AlCl3·6H2O 0.1，CuCl2·H2O 0.1，H3BO40.05。

1.1.5 儀器與設(shè)備

Thermal Cycler (My Cycler) PCR儀，美國(guó) Bio-Rad 公司；DYY-8C型電泳儀，北京六一儀器廠；HQL300B恒溫大幅振蕩搖床，武漢中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司；CR21G高速冷凍離心機(jī)，日本Hitachi公司；Legend Micro17R高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；SKP-02.420電熱恒溫培養(yǎng)箱，黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司；Agilent Technologies1260高效液相色譜，美國(guó)Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 游離表達(dá)載體的構(gòu)建(以glcP基因?yàn)槔?

分別以B.subtillis168基因組、B.amyloliquefaciensHZ-12基因組和B.licheniformisWX-02基因組，根據(jù)表3相對(duì)應(yīng)的引物，擴(kuò)增出P43啟動(dòng)子、glcP基因、終止子TamyL。純化回收PCR產(chǎn)物，以P43-F、TamyL-R為引物通過(guò)SOE-PCR連接起來(lái)，與pHY300PLK質(zhì)粒分別用BamH I和XbaI進(jìn)行雙酶切，用T4 DNA連接酶連接PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。用pHY300-F和pHY300-R對(duì)單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，初步確定為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子后，抽取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和DNA測(cè)序驗(yàn)證，成功構(gòu)建的游離表達(dá)載體命名為pHYglcP。

1.2.2 單基因游離表達(dá)工程菌株的構(gòu)建

將游離表達(dá)載體的pHYglcP、pHYgalP-E、pHYidolT1-C和空載體pHY300PLK電轉(zhuǎn)化至HZΔptsH感受態(tài)中，涂布于Tet抗性平板，37 ℃靜置培養(yǎng)。挑選轉(zhuǎn)化子單菌落于Tet平板上劃線，用pHY300-F、pHY300-R進(jìn)行PCR菌落驗(yàn)證。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)條件

從活化的平板上挑取單菌落接種于50 mL液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min下培養(yǎng)9 h，攜帶質(zhì)粒的菌株培養(yǎng)基需加入相應(yīng)的抗生素，培養(yǎng)12 h左右。以3%(v/v)的接種量接種于50 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min，培養(yǎng)40 h。

1.2.4L-酪氨酸液相檢測(cè)

1 mL發(fā)酵液加入0.6 mL 1 mol/L HCl 渦旋振蕩1 h，12 000 r/min離心3 min后，取上清液，用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾。色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：V(甲醇)∶V(pH 4.0，100 mmol/L醋酸鈉)=10∶90；流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)重復(fù)，采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，評(píng)估數(shù)據(jù)差異的顯著性，計(jì)算出平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，采用Origin 8.5進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 游離表達(dá)載體的構(gòu)建

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌內(nèi)均存在非磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑[18-20]。賴(lài)聯(lián)賀等[21]通過(guò)敲除谷氨酸棒狀桿菌ptsH基因激活非磷酸轉(zhuǎn)移酶葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，過(guò)表達(dá)自身來(lái)源肌醇透性酶1編碼基因iolT1，使得L-絲氨酸產(chǎn)量提高了5.1倍。借鑒上述思路，在HZΔptsH中過(guò)表達(dá)3種非磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，包括大腸桿菌來(lái)源半乳糖透性酶基因galP、谷氨酸棒狀桿菌來(lái)源肌醇透性酶基因idolT1以及解淀粉芽胞桿菌自身來(lái)源的glcP基因，以期強(qiáng)化非磷酸轉(zhuǎn)移酶葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，提高L-酪氨酸的產(chǎn)量。

按照1.2.1中所述的方法構(gòu)建游離表達(dá)載體，根據(jù)表3引物擴(kuò)增出P43啟動(dòng)子、終止子TamyL、glcP基因、galP-E基因、idolT1-C基因，片段大小與理論值大小一致(分別是305、501、1 215、1 395和1 476 bp)，凝膠電泳驗(yàn)證圖如圖1所示。SOE-PCR產(chǎn)物大小分別為2 021、2 201和2 282 bp，純化后與pHY300PLK載體分別用BamH I和XbaI、SmaI和XbaI、EcoR I和XbaI進(jìn)行雙酶切，用T4 DNA連接酶連接后并轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。選取驗(yàn)證正確的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒并送至武漢擎科公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果比對(duì)顯示序列正確，表明pHYglcP、pHYgalP-E、pHYidolT1-C質(zhì)粒構(gòu)建成功。

泳道1～5-P43啟動(dòng)子、TamyL終止子、glcP基因、galP-E基因、idolT1-C基因PCR產(chǎn)物驗(yàn)證圖1 基因片段PCR擴(kuò)增凝膠電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis of gene fragment PCR amplification

2.2 游離表達(dá)菌株的構(gòu)建

利用1.2.2中所述的方法構(gòu)建游離表達(dá)工程菌株HZΔptsH/pHYglcP、HZΔptsH/pHYgalP-E、HZΔptsH/pHYidolT1-C，并利用表3中相應(yīng)的引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，條帶大小分別為2 321、2 501和2 582 bp，PCR驗(yàn)證電泳圖如圖2所示，條帶大小與理論值一致，并送往測(cè)序公司進(jìn)一步驗(yàn)證堿基序列，比對(duì)結(jié)果無(wú)誤，表明工程菌株構(gòu)建成功。

泳道1-引物pHY300-F和pHY300-R驗(yàn)證HZΔptsH/pHYglcP(2 321 bp);泳道2-引物pHY300-F和pHY300-R驗(yàn)證HZΔptsH/pHYgalP-E(2 501 bp);泳道3-引物pHY300-F和pHY300-R驗(yàn)證HZΔptsH/pHYidolT1-C(2 582 bp)圖2 菌落PCR驗(yàn)證凝膠電泳圖Fig.2 Gel electrophoresis of colony PCR verification

2.3 強(qiáng)化非磷酸轉(zhuǎn)移酶葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑對(duì)L-酪氨酸合成的影響

按照1.1.4和1.2.3小節(jié)的發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對(duì)工程菌株HZΔptsH/pHY300、HZΔptsH/pHY-P43glcP、HZΔptsH/pHY-P43galP-E、HZΔptsH/pHY-P43idolT1-C進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證，發(fā)酵周期40 h。發(fā)酵終點(diǎn)檢測(cè)生物量OD600值和L-酪氨酸產(chǎn)量。結(jié)果如圖3所示。

圖3 表達(dá)非磷酸轉(zhuǎn)移酶葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑基因?qū)-酪氨酸產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of expressing the non-phosphotransferase glucosetransport pathway genes on L-tyrosine production注：星號(hào)指示與對(duì)照菌株HZΔptsH/pHY300的數(shù)據(jù)相比，具有顯著性差異(P<0.05)

由圖3可知，3株工程菌株生物量較對(duì)照菌株明顯降低，工程菌株HZΔptsH/pHY-P43glcP的L-酪氨酸產(chǎn)量較對(duì)照菌株HZΔptsH/pHY300提高22%，達(dá)到了264.61 mg/L，推測(cè)其原因，解淀粉芽胞桿菌的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)包括兩種：磷酸轉(zhuǎn)移酶葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和非磷酸轉(zhuǎn)移酶葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，前者可消耗大量的磷酸烯醇式丙酮酸，后者不消耗磷酸烯醇式丙酮酸。相比之下，通過(guò)增強(qiáng)表達(dá)glcP基因強(qiáng)化非磷酸轉(zhuǎn)移酶葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，可分擔(dān)一部分磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)所轉(zhuǎn)運(yùn)的葡萄糖，從而降低磷酸烯醇式丙酮酸的消耗，促進(jìn)更多的磷酸烯醇式丙酮酸用于L-酪氨酸合成[16-17]，從而提高其產(chǎn)量。而過(guò)表達(dá)大腸桿菌galP基因和谷氨酸棒狀桿菌idolT1基因?qū)-酪氨酸產(chǎn)量無(wú)顯著性的影響，推測(cè)其原因，可能是由于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能依賴(lài)特定宿主菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，來(lái)自大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌的異源轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在芽胞桿菌中難以正常組裝到細(xì)胞模上，故不能發(fā)揮其功能。改造非磷酸轉(zhuǎn)移酶葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)在氨基酸的代謝工程中顯示了良好的效果，然而針對(duì)解淀粉芽胞桿菌的改造尚未見(jiàn)報(bào)道，本文借鑒谷氨酸棒桿菌強(qiáng)化絲氨酸合成的思路[21]，通過(guò)對(duì)比分析不同來(lái)源的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因?qū)-酪氨酸合成的影響，證明過(guò)表達(dá)解淀粉芽胞桿菌自身glcP基因可促進(jìn)L-酪氨酸的合成，挖掘到了可增強(qiáng)酪氨酸合成的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，為解淀粉芽胞桿菌非磷酸轉(zhuǎn)移酶葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的改造和L-酪氨酸代謝工程育種提供了有效的基因原件，具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用機(jī)制。

3 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了系列單基因游離表達(dá)工程菌株HZΔptsH/pHY-P43glcP、HZΔptsH/pHY-P43galP-E、HZΔptsH/pHY-P43idolT1-C，首次探究了改造非磷酸轉(zhuǎn)移酶葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑對(duì)解淀粉芽胞桿菌合成L-酪氨酸的影響，發(fā)現(xiàn)系列工程菌株生物量相較于對(duì)照菌株均有不同程度下降，但是菌體生物量的下降對(duì)L-酪氨酸產(chǎn)量并無(wú)明顯影響。強(qiáng)化表達(dá)解淀粉芽胞桿菌自身來(lái)源葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因glcP后，L-酪氨酸產(chǎn)量提高了22%。本研究證實(shí)了改造解淀粉芽胞桿菌自身非磷酸轉(zhuǎn)移酶葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑對(duì)L-酪氨酸合成影響顯著，為解淀粉芽胞桿菌合成L-酪氨酸的代謝工程育種提供了重要的思路。