MMTV-PyMT乳腺癌小鼠模型腫瘤發(fā)生的特點(diǎn)

姚祥龍， 楊 帥， 陳芳慧， 盛 樂， 趙 曼， 阮 健， 魯 山， 李 君， 蔡亞非,

(1.安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，分子酶學(xué)與重大疾病機(jī)理研究安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241000；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

2018年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)報(bào)告顯示，在全球新增的210萬例癌癥病例中，乳腺癌以11.6%的發(fā)病率與肺癌并列第一，乳腺癌在女性癌癥中以46.3%的發(fā)生率和13.0%的死亡率成為女性癌癥霸主，嚴(yán)重威脅了現(xiàn)代女性的健康[1]。乳腺癌小鼠模型是乳腺癌疾病發(fā)生機(jī)理和藥效學(xué)評(píng)價(jià)中的重要工具，一般乳腺癌小鼠模型主要分為移植瘤和原發(fā)性瘤[2-3]。原發(fā)性乳腺癌模型保留有正常乳腺組織中的各類細(xì)胞和精細(xì)結(jié)構(gòu)，擁有癌細(xì)胞發(fā)生和生長(zhǎng)的微環(huán)境，這種高度的還原性，使原發(fā)性乳腺癌模型無論在組織學(xué)，還是在病理學(xué)方面都擁有比移植瘤更高的擬真性，因此，原發(fā)性的乳腺癌小鼠模型成為乳腺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移機(jī)理的理想模型[4-6]。

PyMT、ERBB2(HER-2)、PyMT、Wnt-1是一類目前研究較為明確的癌基因[7-9]，MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠就是特定的剝離MMTV病毒這類導(dǎo)致小鼠乳腺腫瘤的重要病毒的組織特異啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，用來介導(dǎo)PyMT癌基因在乳腺中高表達(dá)，從而誘發(fā)乳腺上皮細(xì)胞中PyMT基因的表達(dá)失控，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞的惡性增殖，導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生[10-11]。這種原發(fā)性的乳腺癌小鼠具有癌癥自發(fā)率高，模型構(gòu)建成本低，個(gè)體差異小，短時(shí)間能獲得大量樣本等優(yōu)點(diǎn)，因此被選為乳腺癌模型中的經(jīng)典模型[12]。MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠模型擁有腫瘤發(fā)生時(shí)間早，生長(zhǎng)速度快，發(fā)病進(jìn)程高度與人體腫瘤病理相似、和實(shí)驗(yàn)易重復(fù)等客觀優(yōu)點(diǎn)常被用來當(dāng)作乳腺癌模型。故本實(shí)驗(yàn)采用MMTV-PyMT乳腺癌轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對(duì)象，觀察在完整生命周期內(nèi)不同性別、不同周齡下的癌癥發(fā)展過程與病理變化指標(biāo)，以研究該模型的客觀規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)環(huán)境

MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠購買于南方模式動(dòng)物中心，飼養(yǎng)在可自由獲取水和食物的鼠籠中，鼠房?jī)?nèi)溫度(23～28℃)和濕度(50%～80%)保持相對(duì)恒定，維持12小時(shí)的光-暗循環(huán)。

1.2 主要試劑

Taq酶、dNTP Mixture、10×PCR buffer等均購自寶生物工程(大連)有限公司，Tris-Base、EDTA·NA2、SDS、NaCl、蛋白酶K、DNA marker、6×DNA loading buffer、瓊脂糖以及引物合成等購自于生工生物工程(上海)股份有限公司，伊紅染色液和蘇木精染色液購自博士德生物工程有限公司。

1.3 主要儀器

恒溫混勻儀(杭州米歐儀器有限公司)、PCR儀(杭州朗基科學(xué)儀器有限公司)、Tanon電泳系列(上海天能科技有限公司)、電泳Tanon-2500全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析儀(上海天能科技有限公司)、半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)Leica RM2245(Leica)，Olympus BX61顯微鏡(奧林巴斯(中國)有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 基因型的鑒定 MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠的基因組DNA從小鼠尾尖或耳尖提取。小鼠的基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，引物信息為：5′-CAAATGTTGCTTGTCTGGTG-3′ ∶ 5′-GTCAGTCGAGTGCACAGTTT-3′ ∶ 5′-GGAAGCAAGTACTTCACAAGGg-3′ ∶ 5′-GGAAAGTCACTAGGAGCAGGG-3′。PCR反應(yīng)體系如表1。

表1 PCR反應(yīng)體系

根據(jù)上述的PCR反應(yīng)體系，對(duì)PyMT進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，條件如下：94℃3min，94℃30s，60℃1min，72℃30s，35個(gè)循環(huán)，72℃保溫10min，4℃2min。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。PCR產(chǎn)物與6×DNA loading buffer按照5 ∶ 1的比例充分混勻，10μl的混合樣品被添加于1%瓊脂糖凝膠上樣孔中，100V 80mA進(jìn)行電泳，30min后在凝膠系統(tǒng)成像儀下拍照。

1.4.2 一般形態(tài)學(xué)觀察 記錄小鼠配種，子代出生時(shí)間等關(guān)鍵信息。小鼠出生后21天左右對(duì)雌雄小鼠進(jìn)行分籠、編號(hào)及基因型的鑒定，以每?jī)商煲淮蔚念l率觀察MMTV-PyMT雌雄小鼠的腫瘤是否發(fā)生，記錄發(fā)生時(shí)間，發(fā)生位置等相關(guān)數(shù)據(jù)。密切關(guān)注雌雄小鼠的活動(dòng)狀態(tài)和死亡情況，做好記錄。

1.4.3 組織病理學(xué)切片及染色 取不同時(shí)期的腫瘤組織，放入4%中性甲醛中固定24h，常規(guī)石蠟包埋、切片以及HE染色，顯微鏡下觀察腫瘤組織病理學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 基因型的鑒定

MMTV-PyMT(+)雄性小鼠與FVB(-)雌性小鼠交配，新生的MMTV-PyMT小鼠在表觀上與野生型小鼠無任何區(qū)別。每只小鼠的基因型均被鑒定，鑒定結(jié)果如圖1B所示，MMTV-PyMT陽性小鼠基因檢測(cè)條帶為550bp，結(jié)果中樣本1、2均為MMTV-PyMT陽性小鼠，即基因型為MMTV-PyMT(+)。而樣品3、4、5、6均無明顯條帶，所以樣品3、4、5和6均為MMTV-PyMT陰性小鼠即FVB小鼠。

圖1 MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠配種模式圖和基因型鑒定圖

2.2 雌性和雄性發(fā)病時(shí)間和生存時(shí)間的比較

所有MMTV-PyMT陽性小鼠均會(huì)自發(fā)性地產(chǎn)生腫瘤。但是，雌性小鼠在發(fā)病時(shí)間上遠(yuǎn)早于雄性，雌性MMTV-PyMT小鼠在出生后第8周就會(huì)發(fā)生腫瘤，而雄性小鼠則在第19周才會(huì)產(chǎn)生腫瘤。雄性小鼠罹患腫瘤后的存活時(shí)間為26周，相較于雌性小鼠的12周存活時(shí)間更長(zhǎng)，如圖2A所示。MMTV-PyMT雌雄小鼠發(fā)生腫瘤后的生存曲線如圖2B、2C所示，MMTV-PyMT雌性小鼠在第15周時(shí)開始有個(gè)體死亡，至19周時(shí)MMTV-PyMT雌性小鼠均已死亡(N=11)。而雄性MMTV-PyMT小鼠最早個(gè)體死亡時(shí)間在第39周，最長(zhǎng)存活時(shí)間不超過46周(N=8)。根據(jù)觀察，如圖2D所示，雌性MMTV-PyMT小鼠最先發(fā)生病變的乳區(qū)為第三乳區(qū)。與雄性小鼠相比較，雌性小鼠腫瘤的生長(zhǎng)速度更快，存活時(shí)間更短。

圖2 MMTV-PyMT小鼠腫瘤發(fā)生特點(diǎn)

2.3 腫瘤不同時(shí)期的HE染色

MMTV-PyMT雌性小鼠自發(fā)的腫瘤均為浸潤性導(dǎo)管癌[12]。雌性MMTV-PyMT小鼠第11周時(shí)的乳腺組織染色結(jié)果顯示：在第11周時(shí)乳腺腫瘤還處于早期的導(dǎo)管浸潤癌階段，但癌細(xì)胞已開始突破乳腺導(dǎo)管上皮的基膜，在乳腺間質(zhì)中已經(jīng)出現(xiàn)散布的癌細(xì)胞巢。在第14周時(shí)癌細(xì)胞開始廣泛向乳腺間質(zhì)浸潤，癌組織與乳腺間質(zhì)相互混雜，形成了多變的病理圖像。在第19周時(shí)，腫瘤已經(jīng)發(fā)展到末期階段，乳腺組織各個(gè)部分已經(jīng)完全無法區(qū)分，癌細(xì)胞呈現(xiàn)巢團(tuán)狀排列，細(xì)胞核增大，腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)出彌散性分布、細(xì)胞大小不等、質(zhì)實(shí)，細(xì)胞間推擠或重疊，細(xì)胞大小形態(tài)不同，并伴隨出血現(xiàn)象。

圖3 正常小鼠乳腺和不同時(shí)期MMTV-PyMT雌性小鼠腫瘤組織HE染色

3 討論

Neu酪氨酸激酶的異?；罨且l(fā)小鼠乳腺上皮細(xì)胞有關(guān)腺癌的關(guān)鍵性因素，其中主要因素是由小鼠乳腺癌病毒MMTV轉(zhuǎn)錄調(diào)控和多瘤病毒的T抗原所介導(dǎo)的Neu酪氨酸激酶的特異性表達(dá)。將小鼠乳腺癌病毒MMTV基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域與癌基因PyMT整合在一起，通過基因重組技術(shù)導(dǎo)入到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的基因組內(nèi)，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型就是能自發(fā)產(chǎn)生乳腺癌的MMTV-PyMT乳腺癌小鼠模型。這類MMTV-PyMT小鼠由于在乳腺上皮組織中PyMT致癌基因高表達(dá)，誘導(dǎo)正常的上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生。

本研究選取MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠作為研究對(duì)象，研究MMTV-PyMT乳腺癌小鼠模型腫瘤發(fā)生的特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)雌性MMTV-PyMT 小鼠在出生后第 8 周發(fā)生可觸及的腫瘤，隨著雌性小鼠年齡的增加，其余乳區(qū)也陸續(xù)發(fā)生腫瘤，在第13周時(shí)，5對(duì)均已發(fā)生腫瘤。雌性轉(zhuǎn)基因小鼠的腫瘤在第13周后生長(zhǎng)速度極快[13]，快速生長(zhǎng)的腫瘤開始嚴(yán)重影響小鼠的生活質(zhì)量，其活動(dòng)能力和進(jìn)食能力出現(xiàn)嚴(yán)重的下滑。MMTV-PyMT雌性小鼠最早死亡時(shí)間在15周，至19周時(shí)所有雌性小鼠均已死亡。此前，雄性MMTV-PyMT 轉(zhuǎn)基因小鼠尚未表現(xiàn)出任何異常，乳腺區(qū)域也未觸摸到明顯的硬塊，但是第19周雄性MMTV-PyMT小鼠罹患腫瘤，雄性小鼠罹患腫瘤后最早死亡時(shí)間在第39周，于第46周時(shí)全部死亡，帶腫瘤的生存時(shí)間為26周。

MMTV-PyMT乳腺癌模型小鼠雌雄性小鼠均可自發(fā)產(chǎn)生腫瘤，但是發(fā)生時(shí)間和存活時(shí)間有較大的差異，雌性小鼠發(fā)病早，轉(zhuǎn)移快，存活時(shí)間短，雄性小鼠發(fā)病晚，存活時(shí)間長(zhǎng)。雌性MMTV-PyMT小鼠在腫瘤發(fā)生后大約2～3周時(shí)間，原位腫瘤細(xì)胞即開始發(fā)生轉(zhuǎn)移，同時(shí)各個(gè)乳區(qū)的腫瘤增長(zhǎng)極快，小鼠身體負(fù)擔(dān)加重，不久就會(huì)死亡[12]。MMTV-PyMT乳腺癌模型小鼠能較為真實(shí)的模擬人體乳腺腫瘤發(fā)生的過程，從發(fā)生、轉(zhuǎn)移到擴(kuò)散都有著較為明確的時(shí)間間隔并且其整個(gè)過程的組織形態(tài)學(xué)變化與人乳腺癌的發(fā)展過程極其相似，是臨床研究乳腺癌發(fā)病機(jī)理和藥物篩選可靠的模型。MMTV-PyMT雄性小鼠晚成瘤和長(zhǎng)存活時(shí)間的特性，一方面為MMTV-PyMT模型小鼠種群繁衍提供了有利條件，另一方面也表明雌雄個(gè)體間差異在腫瘤形成過程中也是重要的影響因素，利用該模型可以更深入地探究這種機(jī)制，為臨床乳腺癌的發(fā)病機(jī)理研究提供參考。