運用組織培養(yǎng)建立藤茶快速繁殖體系的研究

廖璐婧 江念 孫紫薇

摘要：以帶芽的藤茶（Ampelopsis grossedentata）莖段為試驗材料，研究藤茶組織培養(yǎng)過程中各個階段的培養(yǎng)基和激素配比以及煉苗的基質配比。結果表明，藤茶組培苗的快速繁殖體系中，最佳初代培養(yǎng)基為MS+1.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+2g/L PVP;初代莖段培養(yǎng)愈傷組織的最佳基質配比為MS+4.0mg/L6-BA+2.0mg/L ZT+1.0mg/L NAA;藤茶芽的最佳增殖培養(yǎng)基為MS+2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+2.0mg/LZT;最佳壯苗培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA;最佳生根培養(yǎng)基為NAA（0.1mg/L）+TBA（0.5mg/L），生根率可達到86.7%;煉苗階段最佳移栽基質為泥炭十珍珠巖（2：1），并澆以改良霍格蘭營養(yǎng)液，煉苗和移栽成活率可達73%。

關鍵詞：藤茶（Ampelopsis grossedentata）;組織培養(yǎng);快繁體系;培養(yǎng)基;成活率

中圖分類號：Q813.1⁺2;S567.23⁺9 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）09-0171-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.09.037

藤茶（Ampelopsis grosseclentata）在中國食用、藥用歷史悠久，由于人口清香、數(shù)日不餿，被稱為“神茶”。據(jù)古代醫(yī)典記載，其味甘性涼，可清熱解毒，主治感冒風熱、黃疽型肝炎、咽喉腫痛等[1-3]。目前研究證明，藤茶具有增強免疫力、抗氧化、抗癌、降血糖、降血脂、清熱解毒等功效，且藤茶全株均可入藥，主要功能性成分為黃酮、多酚、多糖等[4-8]。隨著對其功能的不斷認識，藤茶現(xiàn)已成為中國特有的一種茶用和藥用植物。

近年來，由于藤茶種植時間較長且種苗均采用扦插的方式得到，其品種退化較為嚴重，使藤茶的產(chǎn)量及品質均有所下降[9，10]。在長時間扦插繁殖后，需要用組織培養(yǎng)的方式對其品種進行復壯。關于藤茶的組織培養(yǎng)技術雖有報道[11，12]，但是不成體系，重復試驗顯示效果不好。武蕓等[13]于2009年對藤茶的愈傷誘導作用作了初步研究，達到了一定的效果，但沒有成體系。本研究探索了藤茶的組織培養(yǎng)技術，旨在為藤茶的快速繁殖體系提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

帶芽的藤茶莖段。

1.2 試驗方法

1.2.1 初代培養(yǎng)過程 取帶芽的藤茶莖段，清洗干凈后，用75%乙醇溶液泡35s，無菌水洗3次，將清洗過的材料進行消毒。進行初代培養(yǎng)40d后觀察各組愈傷組織的情況并對相應的發(fā)芽率進行統(tǒng)計。

經(jīng)過預試驗，將外植體接種到試驗所研究的培養(yǎng)基上，4種培養(yǎng)基分別為MS培養(yǎng)基、1/2MS培養(yǎng)基、WPM培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中加入不同濃度的生長素，3種生長素分別為6-芐氨基腺嘌吟（6-BA）、萘乙酸（NAA）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP），采用L₁₆（4⁴）設計正交試驗，試驗方案見表1。

1.2.2 繼代培養(yǎng)（芽的增殖培養(yǎng)）取初代培養(yǎng)中萌發(fā)的藤茶芽在培養(yǎng)基上進行繼代增殖培養(yǎng)。在初代培養(yǎng)芽的基礎上進行培養(yǎng)，這一階段的培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基，探討不同濃度激素處理對其生長的影響，3種激素為芐氨基腺嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）、玉米素（ZT），正交試驗設計見表2。

1.2.3 對培養(yǎng)苗進行壯苗處理在前一階段的試驗中，初代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)雖然得出藤茶的芽，但是芽普遍比較贏弱、矮小。如果直接誘導生根，將會出現(xiàn)損失，在這一階段需要對芽進行適當?shù)貕衙缣幚?，?jīng)過壯苗處理的芽更利于后續(xù)的培養(yǎng)。在這一階段，進行壯苗培養(yǎng)的目的主要是促進莖的生長。

在對培養(yǎng)苗進行壯苗處理的過程中，培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，在MS培養(yǎng)基中添加不同濃度的6-BA和NAA進行調節(jié)，對兩種調節(jié)劑的3個濃度進行正交試驗，設計方案見表3，培養(yǎng)30d后進行觀察并統(tǒng)計苗高和真葉數(shù)。

1.2.4 誘導生根 通過前一階段的培養(yǎng)，藤茶長出無根苗，在這一階段對得到的無根苗進行生根處理使之長出不定根。誘導生根主要從不同的培養(yǎng)基和激素方面進行調節(jié)。將經(jīng)過壯苗處理后得到的無根苗基部的愈傷組織和多余的葉片去除，移人生根培養(yǎng)基中。以4種不同的培養(yǎng)基及3種不同激素的4種濃度進行正交試驗，試驗方案見表4。

1.2.5 生根后壯苗培養(yǎng) 由于前階段培養(yǎng)基中生長素的濃度過大，得到的藤茶無菌苗生根后其頂芽的生長受到一定的抑制，植株生長緩慢。這一階段將已經(jīng)生根的無菌苗移入無激素的MS培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為30d，主要目的是對苗進行壯苗處理，為下一步的移栽進行準備。

1.2.6 煉苗及移栽 將試驗中得到的生根苗移入相應的基質中進行煉苗處理，采用的基質為：①泥炭和珍珠巖進行混合（質量比為2：1）;②全河沙;③紅黃壤和河沙進行混合（質量比為2：1）。試驗中所用基質在苗移人之前均進行高溫高壓消毒。

移栽：對經(jīng)過壯苗處理的生根苗進行清洗，移栽入裝有基質的培養(yǎng)器皿中，澆足水，基質中以改良霍格蘭營養(yǎng)液為營養(yǎng)成分，澆足營養(yǎng)液和相應的水后用薄膜進行覆蓋，以確保培養(yǎng)基實時濕潤。將經(jīng)過壯苗處理的移栽苗放置于培養(yǎng)室中煉苗，觀察其生長狀況，并將成活小苗移栽，30d后統(tǒng)計成活率。

1.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

所有培養(yǎng)基均加入6g幾瓊脂固化。初代培養(yǎng)過程中溫度為2021℃，繼代培養(yǎng)過程中溫度為23～25℃。培養(yǎng)過程中的光照時間為每天12h，初代培養(yǎng)過程中的光照強度為1800lx，后續(xù)各階段光照強度均為4000lx。

2 結果與分析

2.1 初代培養(yǎng)

2.1.1 藤茶莖段初代培養(yǎng) 在藤茶組織初代培養(yǎng)過程中，外植體為帶芽的莖段，通過誘導其芽的萌發(fā)，得到相應無菌體系。接種10d后有愈傷組織形成，20d后芽開始萌動，30d后葉片開始萌發(fā)，通過觀測不同的處理組，有的處理長勢較好，有的處理開始有死亡趨勢。

通過正交試驗法對初代培養(yǎng)過程中的培養(yǎng)基進行篩選，結果見表5和表6。由表5和表6可知，4種因素對藤茶莖段萌芽率的影響排序為：6-BA>NAA>PVP>基本培養(yǎng)基。由表6方差分析可知，6-BA和NAA對藤茶莖段蔭芽率的影響均達到了顯著水平（P<0.05），其余因素影響不顯著（P>0.05）。在藤茶組織培養(yǎng)初代過程中6-BA和NAA是其主要影響因素。由表5可得最佳組合為2號，即MS+1.5mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+2g/L PVP為最佳初代培養(yǎng)基。

2.1.2 藤茶莖段初代培養(yǎng)中愈傷組織的發(fā)生 藤茶莖段在初代培養(yǎng)過程中，在芽萌發(fā)的同時，芽基部的切口處普遍有愈傷組織的發(fā)生，各試驗組愈傷組織的發(fā)生狀況見表7。

試驗組4、7、8、13、16在培養(yǎng)基中處理后，數(shù)天后藤茶莖段死亡，不形成愈傷組織。在后續(xù)觀察中，雖然試驗組1、5、9、10、12萌發(fā)了大量的芽，但是愈傷組織較小。其他試驗組都形成了愈傷組織，特別是試驗組2和3，芽萌發(fā)率高，形成的愈傷組織也最大。不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)造成愈傷組織的顏色、質地及愈傷組織量有明顯差別。顏色從黃色、黃綠色到綠色，質地有的較疏松，有的則較致密。黃色和黃綠色愈傷組織的質地相對較疏松，綠色愈傷組織表面平滑且比較堅硬致密。從愈傷組織直徑大小來看，2號培養(yǎng)基和6號培養(yǎng)基中的愈傷組織最多，但結合發(fā)芽率等因素，2號培養(yǎng)基比較適于藤茶莖段外植體愈傷組織的誘導。

2.2 繼代培養(yǎng)

2.2.1 芽的增殖培養(yǎng) 藤茶芽的增殖培養(yǎng)試驗結果見表8。由表8可知，在試驗考察的3個因素中，6-BA對藤茶芽的增殖影響最大，其次為NAA，ZT的影響最小。由表9的方差分析可知，6-BA的濃度在藤茶芽的增殖培養(yǎng)中達到顯著影響（P<0.05），其余兩個因素的影響均不顯著。由表8可知，最優(yōu)組合為4，即MS+2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+0.5mg/LZT。試驗組4的平均增殖系數(shù)達到了3.47。

2.2.2 愈傷組織的增殖培養(yǎng) 在愈傷組織的增殖培養(yǎng)過程中，通過觀察得出，藤茶芽基部形成的愈傷組織大概可以分為兩大類。第一類，愈傷組織表面光滑，綠色，質地密;第二類，愈傷組織表面光滑度較低，黃褐色或黃綠色，質地疏松。兩種愈傷組織中第一類成芽較易，因此在后續(xù)試驗中將這類愈傷組織擴大繁殖，以利于芽的增殖。

2.3 壯苗培養(yǎng)

初代培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)過程中，芽的生長受到高濃度細胞分裂素的抑制，在進行中高濃度細胞分裂素培養(yǎng)后，在壯苗階段緊接著進行低濃度激素的培養(yǎng)，可以調節(jié)植物細胞內的激素平衡，從而有利于植物生長及以后階段的生根和移栽。

經(jīng)過初代培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)2個過程處理后，芽的生長受到了一定程度的抑制，其原因為這兩階段中激素的濃度相對較高。因此，在壯苗階段應采取低濃度的激素對其進行培養(yǎng)，使苗的頂芽得到生長，從而有利于生根、移栽以及以后植物的生長。

藤茶壯苗培養(yǎng)試驗結果見表10，分別對平均苗高和平均真葉數(shù)進行方差分析得表11和表12。由表11可知，BA和NAA的濃度對苗高的影響均達到了顯著水平（P<0.05）。由表12可知，6-BA的濃度對真葉數(shù)有極顯著影響（P<0.01），NAA濃度對真葉數(shù)有顯著影響（P<0.05）。在平均苗高方面，5號組合（MS+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA）的效果最好;在平均真葉數(shù)方面，7號組合（MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA）效果最好，但該組合的平均苗高太小，僅1.34cm。由于試管苗高是衡量試管苗質量的一個重要指標，因此應選擇5號組合為最佳壯苗培養(yǎng)基。

2.4 誘導生根

表13為不同處理條件下藤茶無根苗的生根率，從表13中可以得出，不同生長素的種類和濃度對藤茶無根苗的生根率、平均生根數(shù)均有較大影響。

2.4.1 基本培養(yǎng)基對藤茶生根的影響 4種基本培養(yǎng)基的生根率排序為MS>1/2 MS>WPM>N6。除MS培養(yǎng)基外，1/2 MS培養(yǎng)基的生根率也較高，但是MS培養(yǎng)基苗的長勢明顯比1/2 MS培養(yǎng)基好，因此，藤茶生根的基本培養(yǎng)基仍以MS為佳。

2.4.2 生長素對藤茶生根的影響 IBA和NAA廣泛應用于生根，當單獨添加一種生長素時，0.1～1.0mg/L的NAA或IBA都可以誘導生根。在NAA的濃度為0.1mg/L、IBA的濃度為0.5mg/L時，生根率達到了86.7%。

2.4.3 6-BA對藤茶生根的影響

藤茶試管苗生根率和6-BA濃度呈現(xiàn)出負相關的關系，當6-BA濃度為1.5mg/L時，生根率為0。

2.5 生根后壯苗培養(yǎng)

由于較高濃度的生長素有利于根的生長，在生根培養(yǎng)過程中使用了較高濃度的生長素，但是在此濃度環(huán)境條件下芽的萌發(fā)受到抑制。在這種情況下如果直接移栽生根苗，苗的成活率可能會大大降低。因此，對生根苗進行壯苗培養(yǎng)很有必要，將生根苗移人無激素的MS培養(yǎng)基中，生長7d后生根苗長出新葉，14d后新葉片葉面積為老葉片的2倍。經(jīng)過壯苗培養(yǎng)后對生根苗的生長具有明顯促進作用，為后續(xù)移栽提高成活率奠定了基礎。

2.6 煉苗及移栽

由表14可以看出，在最后的煉苗培養(yǎng)過程中，泥炭和珍珠巖混合作為煉苗基質能夠顯著提高移栽成活率，在試驗考察的3種基質中效果最好，成活率達到73%。

3 結論與討論

通過對藤茶帶芽的外植體進行組織培養(yǎng)研究，得出藤茶組培快速繁殖從誘導生根到煉苗移栽的完整體系（圖1），其主要結果為：

1）通過對培養(yǎng)基以及不同濃度生長激素進行研究，以L₁₆（4⁴）正交試驗對初代培養(yǎng)基配方進行優(yōu)化，得出最佳配方為MS+1.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+2g/L PVP。其中6-BA和NAA的濃度是影響藤茶莖段芽萌發(fā)的主要因素。

2）藤茶帶芽莖段初代培養(yǎng)過程中，在芽的基部普遍有愈傷組織的發(fā)生，但是最佳培養(yǎng)基組合為MS+4.0mg/L 6-BA+2.0m/L ZT+1.0mg/L NAA，且愈傷組織分化不定芽的能力強。

3）通過試驗得出，最佳增殖培養(yǎng)基配方為MS+2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA+2.0mg/L ZT，在此條件下增殖系數(shù)可達3.47。6-BA濃度為影響藤茶無菌芽增殖系數(shù)的主要因素。

4）經(jīng)繼代培養(yǎng)的藤茶幼苗較弱小，需經(jīng)壯苗培養(yǎng)再誘導生根。壯苗培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA。

5）不同培養(yǎng)基、激素種類以及激素濃度對藤茶組培苗生根均有影響。培養(yǎng)基的選擇上以MS培養(yǎng)基為最佳;激素濃度上，單獨添加NAA和IBA都能誘導藤茶生根，但是最佳配方為NAA（0.1mg/L）+IBA（0.5mg/L），在此條件下藤茶組培苗生根率達到了86.7%。

6）在生根培養(yǎng)后，雖然藤茶苗根部已經(jīng)發(fā)育較好，但是整體植物較為贏弱，此時轉入無激素的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)可以促進生長，為移栽打好基礎。

7）在移栽煉苗階段，使用改良的霍格蘭營養(yǎng)液保證營養(yǎng)，最佳的移栽基質為泥炭和珍珠巖相混合，其質量比為2：1，在此條件下煉苗及移栽成活率可達73%。

目前組織培養(yǎng)技術日趨完善，近年甘蔗、梨、艾篙等農(nóng)作物以及白芨等珍貴中藥都有較為完整的組培繁殖體系報道[14-17]，其愈傷組織誘導率達到80%以上，移栽大田成活率達60%以上，基本解決了種苗欠缺問題。雖然已有關于藤茶組織培養(yǎng)的報道[12，13]，但始終停留在誘導愈傷組織上，沒有得出完整的快繁體系。本研究建立了藤茶從誘導愈傷到大田移栽的整個體系，其愈傷誘導率達91.2%，移栽成活率可達73%，和其他植物的組織培養(yǎng)相比處于較高水平，對于藤茶生產(chǎn)具有積極意義。

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收稿日期：2019-12-31

作者簡介：廖璐婧（1981-），女，湖北咸豐人，助理研究員，碩士，主要從事農(nóng)業(yè)資源利用研究，（電話）13402709977（電子信箱）284372681@qq.com。