雙頭渦蟲模型的建立

席興字， 王紅亮， 馬克學(xué)

(1. 新鄉(xiāng)學(xué)院 教育科學(xué)系, 新鄉(xiāng) 453003; 2. 河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 新鄉(xiāng) 453007)

淡水渦蟲屬于扁形動物門渦蟲綱的代表性動物，具有極強的再生能力[1]。渦蟲頭部被切除后，3 d能夠再生出新的眼點，7 d能夠再生出新的頭部[2-3]。著名的遺傳學(xué)大師摩爾根把它描述為 “切不死的動物(Immortal under the edge of the knife)”。此外，一條渦蟲無論橫切多少段，總是面向前端的傷口再生出頭，面向后端的傷口再生出尾。摩爾根認為，從前到后有一種物質(zhì)濃度梯度決定了渦蟲前后軸的極性[4]。在地中海渦蟲(Schmidteamediterranea)中研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin 信號通路對渦蟲前后軸極性的重新建立具有決定作用。用RNAi(RNA interference)技術(shù)抑制β-catenin-1基因表達誘導(dǎo)渦蟲后端再生出頭部，產(chǎn)生雙頭渦蟲[5-6]。但是，β-catenin-1控制了哪些信號分子導(dǎo)致渦蟲前后軸極性的改變?nèi)圆皇智宄?。為了回答這一問題，建立穩(wěn)定可靠的雙頭渦蟲模型就顯得非常重要。鑒于此，作者嘗試建立雙頭渦蟲模型，為渦蟲領(lǐng)域RNAi研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

日本三角渦蟲(Dugesiajaponica)單克隆系，本實驗室建立和保存。本實驗所用的Taq酶，pMD19-T載體、質(zhì)粒DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒等分子生物學(xué)試劑購自寶生物工程有限公司。實驗所用的引物和測序由蘇州金唯志公司完成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和Dj-β-catenin-1基因的克隆

取6條渦蟲用液氮研磨成粉末后加入Trizol 試劑抽提總RNA，然后用RNase-free DNase I 消化模板去除基因組DNA。取2 μg 總RNA用寶生物cDNA合成試劑盒(TaKaRa PrimeScriptTMII 1st strand cDNA synthesis kit, Code No. 6210A)合成cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)日本三角渦蟲β-catenin-1基因序列(GenBank MG599480)設(shè)計一對5′端帶有T7啟動子的特異性引物(上游引物：5′-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGACA ACC ATC GAA TCT TAT CCG CCA G-3′; 下游引物：5′-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGCAT TGT GTA ACC GAA TTA TGT CTGT-3′)擴增1325 bp cDNA序列。PCR產(chǎn)物連接pMD19-T載體，提取質(zhì)粒DNA送金唯志測序，以保證合成dsRNA模板的正確性。

1.2.2 dsRNA的合成

根據(jù)參考文獻[7]，按照MEGAscript RNAi kit (Ambion 1626) 操作說明進行。以上述測序正確的質(zhì)粒為模板，制備PCR反應(yīng)體系：10×buffer 20 μL，dNTP 20 μL，上下游引物各8 μL，Taq酶2 μL，模板50 ng質(zhì)粒DNA，總體積200 μL。PCR參數(shù)如下：94 ℃ 預(yù)變性5 min； 98 ℃變性10 s， 68 ℃ 退火2 min，共33個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物用TaKaRa 試劑盒純化后作為合成dsRNA 模板。1 μg DNA模板加入到反應(yīng)混合液中(含有2 μL 10×T7 reaction buffer, 8 μL rNTP mixture, 2 μL T7 enzyme mix, 總體積20 μL)。反應(yīng)混合液在37 ℃孵育4～6 h，再用DNA酶消化模板，產(chǎn)物用5 mol/L醋酸銨沉淀dsRNA, 測定濃度并用瓊脂糖凝膠電泳鑒定完整性。

1.2.3 喂食dsRNA的策略

分別取0.5、1和2 μg dsRNA與20 μL牛肝勻漿液混合后喂食 4～6 mm 蟲子20條，間隔3 d喂食1次，連續(xù)喂食4次。喂食結(jié)束后，次日把渦蟲從咽前咽后切割成頭部、軀干和尾部3個片段，觀察渦蟲再生表型。體視顯微鏡拍照并保存圖片。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 整體原位雜交干擾效果鑒定

PC2基因在渦蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性表達[8]，作為渦蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分子Marker廣泛應(yīng)用于渦蟲再生研究。本實驗所用的DjPC2探針采用Roche 地高辛標(biāo)記試劑盒(SP6/T7, Cat.No. 11175025910)合成。整體原位雜交主要步驟如下：渦蟲用2% HCl處理5 min去除黏液，4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBST洗滌后用系列甲醇脫水，100% 甲醇-20 ℃放置至少2 h，6% H2O2白光漂白16 h，然后經(jīng)100% 甲醇和50%甲醇洗滌后用PBST洗滌2次，用20 μg/mL Proteinase-K處理渦蟲10 min，4%多聚甲醛再次固定20 min，PBST洗滌2次后加入預(yù)雜交液56 ℃ 2 h，然后加入 400 ng/mL 探針 56 ℃ 雜交 16 h。雜交結(jié)束洗滌后用Anti-Dig-AP 抗體(1∶2000稀釋)，BCIP/NBT顯色，Leica DFC300FX 體式顯微鏡拍照保存實驗結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 RNAi- Dj-β-catenin-1 表型觀察

實驗結(jié)果(圖1)顯示，對照組渦蟲切割后都能夠正常再生，頭部片段再生出新的尾，軀干部分前端再生出頭后端再生出尾。RNAi干擾組渦蟲頭部片段的后端和軀干部分的后端卻再生出異位頭部，眼點清晰可見。另外，對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，結(jié)果(表1)表明，雙頭渦蟲表型誘導(dǎo)率與dsRNA的量有濃度效應(yīng)，0.5 μg誘導(dǎo)組雙頭渦蟲表型率為35%±3.8%，1 μg誘導(dǎo)組雙頭渦蟲表型率為70%±10.3%，2 μg 誘導(dǎo)組雙頭渦蟲表型率為100%。

再生10 d；箭頭示后端眼點；Scale bar: 0.5 mm

2.2 整體原位雜交干擾效果鑒定

為了進一步驗證確實形成了雙頭渦蟲，用渦蟲神經(jīng)marker基因DjPC2進行驗證。原位雜交顯示，干擾組渦蟲前后兩端都顯示出渦蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)(圖2)，結(jié)果表明實驗方法正確。干擾Dj-β-catenin-1表達確實能使渦蟲前后軸極性改變。

DjPC2探針檢測，NBT/BCIP顯色

表1 實驗數(shù)據(jù)及統(tǒng)計

3 討論與結(jié)論

自扁形動物開始，動物在體形上開始具備前后左右之分。中樞神經(jīng)系統(tǒng)向前端集中形成腦是動物進化史上的重要事件，但是動物確立前后軸的分子機制仍不十分清楚[9]。在渦蟲中研究表明，wnt/β-catenin信號通路在前后軸極性的建立和維持中具有重要作用[10-11]。目前研究認為，wnt/β-catenin信號沿渦蟲前后軸有一個濃度梯度，后端最強，因此決定渦蟲后端形成尾部結(jié)構(gòu)[5-6]。阻斷wnt/β-catenin信號通路后，表達后端決定基因的細胞不能形成。相反，表達前端決定基因的細胞在后端分化形成，因此再生出后端頭部[11]。眾所周知，Hox基因沿動物前后軸分布，其有序表達是動物正常發(fā)育的基礎(chǔ)[12-13]。阻斷wnt/β-catenin信號通路對Hox基因表達模式有何影響？阻斷wnt/β-catenin信號通路通過何種機制改變細胞的命運，這其中涉及哪些分子機制？因此，建立穩(wěn)定可靠的雙頭渦蟲模型，研究相關(guān)基因的表達模式，是回答這些關(guān)鍵生物學(xué)問題的基礎(chǔ)。本實驗通過喂食渦蟲dsRNA，建立了穩(wěn)定可靠的雙頭渦蟲模型誘導(dǎo)技術(shù)，表型率達到100%。與其他方法相比較，本方案有顯著的優(yōu)勢。除喂食dsRNA外，渦蟲領(lǐng)域RNAi技術(shù)還有顯微注射dsRNA法和喂食表達dsRNA的細菌法[14-15]。顯微注射法需要精密的顯微注射裝置，顯微注射費力費時且普通研究人員很難掌握。喂食細菌法相對容易，但是細菌被誘導(dǎo)后表達的dsRNA的量很難確定，且喂食細菌誘導(dǎo)雙頭渦蟲表型率不高。本實驗建立的喂食dsRNA法量可控，操作簡單，容易實施和推廣，對渦蟲領(lǐng)域RNAi 研究具有參考價值。

致謝：特別感謝上海交通大學(xué)荊清教授和韓曉帥博士提供的技術(shù)指導(dǎo)和幫助！