大豆谷丙轉(zhuǎn)氨酶的結(jié)構(gòu)模型構(gòu)建及其應(yīng)用

林 深， 鐘镕華， 孟繁梅， 鄭曉如， 伍儉兒， 張尚宏

(1. 中山大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 廣州 510275; 2. 中山大學(xué) 生物工程研究中心， 廣州 510275)

谷氨酸-丙酮酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Glutamate-pyruvate transaminase, GPT)，簡稱谷丙轉(zhuǎn)氨酶，又稱丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase)，是自然界中廣泛存在的一種酶，在維持生物正常的葡萄糖和氨基酸代謝中起到重要的作用，更是人體肝病、糖尿病和冠心病等疾病的重要預(yù)測因子[1]。研究表明，谷丙轉(zhuǎn)氨酶皆屬于吡哆醛-5-磷酸(Pyridoxal-5-phosphate, PLP)依賴性酶家族，而吡哆醛-5-磷酸是一種多功能的輔助因子，輔助酶催化氨基酸的各種反應(yīng)，包括轉(zhuǎn)氨、脫羧、外消旋、β-和γ-消除和取代、羥醛縮合反應(yīng)和Claisen反應(yīng)[2-3]。有研究表明，在細(xì)菌的氨基酸代謝中最重要的部分是谷丙轉(zhuǎn)氨酶所催化的代謝反應(yīng)，通過丙氨酸和谷氨酸的相互轉(zhuǎn)化，精確控制丙氨酸和谷氨酸濃度[4]。

盡管GPT的催化機(jī)理已經(jīng)得到了闡釋，但目前對于植物來源GPT的研究很少，三維結(jié)構(gòu)明確的植物GPT更是只有大麥(Hordeumvulgare)來源的GPT(PDB登記號3TCM)[5]。分子模型的構(gòu)建是深入研究蛋白質(zhì)各項性質(zhì)的基礎(chǔ)，構(gòu)建一個新的植物GPT的模型，將對其他同類型酶的研究提供便利與支持。由于解析晶體難度大、耗費高，利用相似度高的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模成為一種被廣為接受且有較高準(zhǔn)確性的方法[6]。使用軟件模擬的方法，得到蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型，探究模型在不同濃度的緩沖溶液中的構(gòu)造變化，可以初步得到蛋白質(zhì)的一些性質(zhì)。

另一方面，近年來，親和標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)純化，例如聚精氨酸標(biāo)簽(Poly-Arginine tag, Arg-tag)、鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽(Calmodulin-binding peptide)、纖維素結(jié)合域(Cellulose-binding domain)、蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶I(Protein disulfide isomerase I, DsbA)、聚組氨酸標(biāo)簽(Poly-Histidine tag, His-tag)、Flag標(biāo)簽(Flag-tag)、鏈霉親和素結(jié)合肽標(biāo)簽(Streptavidin-binding peptide, SBP-tag)等[7]。其中組氨酸標(biāo)簽的應(yīng)用最為廣泛，PDB中接近25%的蛋白質(zhì)是組氨酸標(biāo)記后，通過金屬固定化親和色譜純化得到的[8-9]。然而，組氨酸標(biāo)簽在表達(dá)時可能被包埋于蛋白質(zhì)中而無法被吸附劑吸附，且組氨酸標(biāo)簽可能會影響酶的構(gòu)象[10]，因而在親和層析前預(yù)測組氨酸標(biāo)記后蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，能夠預(yù)判用組氨酸標(biāo)記純化蛋白的可行性。

大豆(Glycinemax)作為一種常見的固氮農(nóng)作物，其材料易得，經(jīng)濟(jì)效益高。在對大豆的研究中發(fā)現(xiàn)GPT存在于大豆的所有組織中[11]，然而目前還沒有關(guān)于大豆谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GlycinemaxGlutamate-Pyruvate Transaminase,GmGPT)三維模型的研究。本文從軟件模擬建模的角度，探究GmGPT的結(jié)構(gòu)特征和活性區(qū)域及其拓展應(yīng)用，為大豆乃至植物來源GPT的研究提供更多的理論準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 大豆谷丙轉(zhuǎn)氨酶序列的獲得

在NCBI數(shù)據(jù)庫里查詢已知的GmGPT的可能序列，共得到了7個已知登錄在數(shù)據(jù)庫中的序列，如表1。

表1 NCBI的protein數(shù)據(jù)庫中大豆的谷丙轉(zhuǎn)氨酶的序列

考慮到序列準(zhǔn)確性和建模的正確性，我們挑選了經(jīng)過驗證且參考序列較多的NP_001237567.2序列作為我們建模的出發(fā)序列，其序列如圖1。

圖1 NP_001237567.2的序列

1.2 Blast搜索，多重序列比對，同源建模

在NCBI的blast程序搜索與NP_001237567.2序列相似度高且已知晶體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，得到對應(yīng)的大麥GPT(PDB登錄號3TCM)和人源GPT(PDB登錄號3IHJ)，序列相似度均大于40%，符合同源建模要求。利用Discovery Studio的Align Multiple Sequences模塊，以BLOSUM矩陣作為多重序列評分矩陣，綜合比對出發(fā)序列和3TCM序列以及3IHJ序列。對比結(jié)果如圖2。利用Discovery Studio(版本號2.5)的Build Homology Models模塊，以3TCM和3IHJ為模板構(gòu)建大豆谷丙轉(zhuǎn)氨酶模型。經(jīng)過簡單的loop修飾得到模型A，并通過UCLA的Saves平臺對模型A的各項建模指標(biāo)進(jìn)行驗證。

1.3 模型A在溶液中的狀態(tài)模擬

應(yīng)用Discovery Studio(版本號2.5)的Solution模塊將模型A分別置于濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25和0.30 mol/L的KH2PO4-Na2HPO4模擬緩沖溶液中(pH 7)，依次采用Steepest Descent及Conjugate Gradient算法，分步采用固定蛋白質(zhì)整體、蛋白質(zhì)主鏈及全部柔性處理，對模型能量最小化[12]。通過UCLA的Saves平臺對各個模型的各項建模指標(biāo)進(jìn)行驗證，取其中指標(biāo)最好的一個模型作為GmGPT的溶液狀態(tài)模型B，并對此模型進(jìn)行活性位點與酶反應(yīng)底物對接的分析。

圖 2 NP_001237567.2，3TCM和3IHJ序列對比圖

1.4 GmGPT組氨酸標(biāo)記模型的探究

在NP_001237567.2序列的C端加上6個組氨酸標(biāo)簽，利用Discovery Studio的Build Homology Models模塊，以3TCM和3IHJ為模板構(gòu)建大豆谷丙轉(zhuǎn)氨酶模型，得到模型C，讓模型C得到與A相同的loop修飾，然后將其置于0.20 mol/L、pH 7的KH2PO4-Na2HPO4模擬緩沖溶液中，依次采用Steepest Descent及Conjugate Gradient算法，分別固定蛋白質(zhì)整體、蛋白質(zhì)主鏈及全部柔性，對模型能量最小化，得到模型D[12]。探究模型D的C端組氨酸標(biāo)簽是否會進(jìn)入蛋白質(zhì)內(nèi)部及組氨酸標(biāo)簽與活性位點的距離，從而判斷組氨酸標(biāo)記GmGPT的可行性。通過Discovery Studio的Calculation Protein Ionization and Residue pK模塊，計算得到模型D的等電點，為后續(xù)表達(dá)和分離純化GmGPT的工作進(jìn)行理論準(zhǔn)備。

圖為NP_001237567.2序列經(jīng)同源建模所得到的單體模型A。圖中蛋白質(zhì)主鏈為灰白色；輔基PLP為櫻桃紅色

2 結(jié)果與分析

2.1 模型A結(jié)構(gòu)及其合理性探究

通過同源建模和loop修飾得到模型，并將可能的輔基PLP的醛基與活性中心Lys291的ε-NH2以Schiff堿連接，得到切除了C端Asp474至Leu4818個殘基的不匹配序列后的模型A(圖3)。在UCLA的Saves平臺驗證后，模型的Verify Score為91.97%，Ramachandran Plot如圖4。Ramachandran Plot顯示模型中氨基酸殘基93.7%位于最合適區(qū)，5.0%位于允許區(qū)，1.0%位于最大允許區(qū)，只有0.3%位于不允許區(qū)。上述結(jié)果顯示出模型A質(zhì)量較好。

圖4 大豆谷丙轉(zhuǎn)氨酶模型A的Ramachandran Plot

2.2 模型B結(jié)構(gòu)及其合理性探究

將模型A在上述溶液中進(jìn)行分子動力學(xué)模擬后，得到6個不同的模型，這6個模型通過UCLA的Saves平臺評估得到的Verify 評分、Errat評分和Prove評分如表2?？梢姰?dāng)緩沖液濃度為0.2 mol/kg時，GmGPT模型的各項評分十分突出，其Verify 評分為97.67%，Errat評分為92.0430，Prove評分為0.0%，表明所建模型是合理的。其結(jié)構(gòu)圖如圖5，中心活性位點結(jié)構(gòu)圖如圖6。該模型有兩個結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域I由Pro5到Phe70和Ile323到Glu473兩端氨基酸序列組成，結(jié)構(gòu)域II由Ala83到Ser322氨基酸序列組成，具體如圖7。利用Discovery Studio的Dock Ligands (LibDock)模塊，分別將谷氨酸、丙酮酸、α-酮戊二酸和丙氨酸與模型B進(jìn)行剛性對接，對接均非常成功，結(jié)合位置均在Lys291-PLP附近?？梢娔Ｐ虰對GPT的4種底物均具有較高的親和性，且Lys291-PLP為酶的活性位點。

表2 不同濃度緩沖溶液模型的各項評分指標(biāo)

圖為模型A在模擬緩沖溶液中進(jìn)行能量最小化后所得到的模型B。圖中蛋白質(zhì)主鏈為灰白色；輔基PLP為櫻桃紅色

我們恢復(fù)了出發(fā)序列C端Asp474至Leu4818個殘基的不匹配序列后，再于C端增加6個His殘基作為組氨酸標(biāo)簽，得到表達(dá)序列。其同源建模后的模型為模型C，如圖8-A。對其進(jìn)行與A同等的loop修飾并在溶液狀態(tài)按照與模型B同樣的方法模擬后，得到模型D，如圖8-B。模型D僅裸露出C端包含組氨酸標(biāo)簽的Asp474至His48714個殘基在外側(cè)，而且距離活性位點較遠(yuǎn)，可以忽略其對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響[13]。通過Discovery Studio的Calculation Protein Ionization and Residue pK模塊，計算得到模型D的等電點為6.51。

圖為模型B活性位點與輔基PLP有相互作用的Ala139，Ser140,Tyr165,Asp249,Tyr252,Lys291,Arg300。圖中蛋白質(zhì)主鏈為灰白色；輔基PLP為櫻桃紅色；有相互作用的氨基酸為藍(lán)色

圖為模型B的結(jié)構(gòu)域。圖中結(jié)構(gòu)域I為藍(lán)色；結(jié)構(gòu)域II為綠色；輔基PLP為櫻桃紅色；其余氨基酸為灰白色

2.3 組氨酸標(biāo)記模型的探究

A為NP_001237567.2序列在C端添加組氨酸標(biāo)簽后，經(jīng)同源建模所得到的單體模型C。B為模型C在模擬緩沖溶液中進(jìn)行能量最小化后所得到的模型D。圖中NP_001237567.2序列所編碼的蛋白質(zhì)主鏈為灰白色；組氨酸標(biāo)簽為黃色；輔基PLP為櫻桃紅

因而可通過親和層析、分子凝膠過濾和離子交換柱層析純化后，利用胰凝乳蛋白酶水解Tyr478和Ser479之間的肽鍵，得到除去標(biāo)簽且純度較高的GmGPT。

3 討論與結(jié)論

GPT在各種生物的代謝中起到重要的作用，而大豆中的GPT更是能在大豆內(nèi)澇缺氧和缺氧后氧濃度恢復(fù)的情況下高效利用溶液中的氮，使植物組織保持活性[11]。對于蛋白質(zhì)研究來說，其結(jié)構(gòu)模型是活性和功能等研究工作的基礎(chǔ)，而礙于解析晶體的技術(shù)原因，利用計算機(jī)同源建模成為一種經(jīng)濟(jì)而又具有一定準(zhǔn)確性的方法[14]。但目前結(jié)構(gòu)明確的植物GPT僅有來源于大麥(Hordeumvulgare)的GPT(PDB登錄號3TCM)。

利用分子動力學(xué)模擬得到目標(biāo)分子來觀察其結(jié)構(gòu)合理性可大大提高研究材料的可靠性。采用組氨酸標(biāo)簽可通過更改基因序列將帶電序列加入到多肽鏈中，大大減輕了活性聚合的難度，提高了生物相容性和可降解性，因此組氨酸序列也常常和對環(huán)境敏感的嵌段活性聚合于某種肽鏈兩端，形成A-C-B三嵌段聚合物，利用其在不同環(huán)境釋放速度不同的特點制成緩釋劑[15-16]。通過對三嵌段聚合物進(jìn)行分子動力學(xué)模擬可了解其溶解度等相關(guān)的物理性質(zhì)，同時也可得知組氨酸標(biāo)簽對肽段結(jié)構(gòu)的影響，為進(jìn)一步的實驗研究篩選可執(zhí)行方案，且此方法已在提純蛋白質(zhì)的研究中被使用[17]。

本研究中使用大豆谷丙轉(zhuǎn)氨酶的可能序列(NP_001237567.2)作為靶序列，可以構(gòu)建出與其他來源的GPT結(jié)構(gòu)相似的模型，且該模型在模擬溶液中能夠形成合理的構(gòu)象，表現(xiàn)出與谷氨酸、丙酮酸、α-酮戊二酸和丙氨酸良好的對接能力，均證實了其作為大豆谷丙轉(zhuǎn)氨酶的三維模型的合理性。對溶液態(tài)模型B的活性位點及結(jié)構(gòu)域的分析將為繼續(xù)深入研究大豆GPT乃至植物GPT的結(jié)構(gòu)功能奠定前期工作基礎(chǔ)。同時，該序列在C端連接組氨酸標(biāo)簽后，可能表達(dá)形成分子量約為54.57 ku、等電點約為6.51、組氨酸標(biāo)簽裸露且遠(yuǎn)離活性位點的單體蛋白質(zhì)，證實了通過親和色譜實現(xiàn)后續(xù)GmGPT的表達(dá)、純化的可行性。

綜上，GmGPT三維模型的構(gòu)建對于豐富資源匱乏的植物GPT三維模型有著重要的意義，也能為大豆的氨基酸代謝的相關(guān)基礎(chǔ)研究提供參考。