AG490拮抗STAT3信號(hào)通路對(duì)慢性哮喘小鼠氣道重塑的影響

苗青，王燕，任亦欣，關(guān)輝，李珍，劉永革，許巍，向莉

支氣管哮喘(哮喘)發(fā)病本質(zhì)是氣道慢性炎癥性疾病，慢性氣道炎癥的反復(fù)持續(xù)可進(jìn)一步造成以平滑肌層增厚、氣道管腔狹窄為特征的氣道重塑病理改變的發(fā)生[1]。大量臨床研究證據(jù)表明：以氣道平滑肌層肥厚為特征的氣道重塑，是造成支氣管哮喘患兒肺功能進(jìn)行性減低和氣道高反應(yīng)性持續(xù)的病理學(xué)基礎(chǔ)[2-3]。研究表明在哮喘病理生理過(guò)程中，氣道平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換(phenotype switch)是引起氣道重塑的重要機(jī)制，即氣道平滑肌細(xì)胞由生理狀態(tài)的收縮型(contractile phenotype)向合成型(synthetic phenotype)轉(zhuǎn)換，造成細(xì)胞收縮功能下降或喪失，導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖、形態(tài)肥大[4-5]。信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducers and activators of transcription-3, STAT3)屬于STAT家族成員之一，被激活后的磷酸化STAT3分子(p-STAT3)可快速移位入核，與靶基因調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合啟動(dòng)下游靶基因表達(dá)。已證實(shí)多種細(xì)胞周期反應(yīng)蛋白均為STAT3信號(hào)通路作用底物，因此STAT3信號(hào)活性與細(xì)胞增生及分化有關(guān)[6-7]。國(guó)內(nèi)已有學(xué)者報(bào)道氣道上皮STAT3信號(hào)通路的異?；钴S與小鼠氣道重塑過(guò)程相關(guān)[8]，但是其在氣道平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換過(guò)程中的具體作用機(jī)制尚不明確?；诖?，本研究采用腹腔注射AG490給藥方式阻斷小鼠STAT3信號(hào)通路，AG490是一種人工合成的苯亞甲基丙二腈脂類(lèi)衍生物，可特異性阻斷JAK2/STAT信號(hào)活化及轉(zhuǎn)導(dǎo)[9]，旨在觀(guān)察特異性拮抗STAT3信號(hào)通路在抑制慢性哮喘氣道重塑過(guò)程中的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

STAT3信號(hào)通路小分子抑制劑AG490購(gòu)自美國(guó)Calbiochem公司；羊抗鼠STAT3單克隆抗體(sc-8019)、羊抗鼠p-STAT3(結(jié)合位點(diǎn)Tyr-705)單克隆抗體(se-8059)、羊抗鼠骨橋蛋白(osteopontin, OPN)單克隆抗體、羊抗鼠α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SM-actin, α-SMA)均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 生物技術(shù)有限公司。羊抗鼠平滑肌22α(Smooth muscle 22 alpha, SM22α)單克隆抗體購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Cell Signaling Technology(CST)公司。SDS-PAGE電泳設(shè)備及轉(zhuǎn)膜儀、光學(xué)顯微鏡、壓縮霧化吸入器、酶標(biāo)儀等購(gòu)自上海生工公司。RT-PCR、cDNA試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司)；卵清蛋白(OVA)、氫氧化鋁Al(OH)3購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。蛋白濃度測(cè)定使用BCA試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SPF級(jí)8周齡BalB/C小鼠30只，體質(zhì)量(18±2.0)g，購(gòu)買(mǎi)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組、哮喘組和AG490干預(yù)組，每組10只小鼠。哮喘組小鼠模型制備方法：第1天和第7天腹腔(intraperitoneal/ip)注射致敏液(內(nèi)含OVA 0.1 mg和氫氧化鋁10 mg)0.2 mL，1次/d，共2次。于第14天起經(jīng)氣管(intratracheal/it)滴入激發(fā)液(20 μg OVA)0.1 mL，每周5次，連續(xù)3周。正常對(duì)照組：致敏和激發(fā)均以PBS鹽水替代。AG490干預(yù)組：AG490按0.4 mg/(kg·d)每周腹腔注射1次，共4周，AG490每5 mg用二甲基亞砜(DMSO)、配成質(zhì)量濃度為0.5 g/L的溶液，OVA激發(fā)方法同哮喘組。

1.3 小鼠肺組織切片染色及氣道病理組織學(xué)觀(guān)察

切取右肺肺門(mén)組織，4%多聚甲醛固定48 h后，常規(guī)脫水、透明及浸蠟包埋，制備厚度為5 μm的石蠟切片。切片經(jīng)常規(guī)脫蠟后進(jìn)行H&E和PAS染色，分別觀(guān)察肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和氣道上皮損傷情況。其中上皮細(xì)胞層增加的厚度也代表上皮細(xì)胞向黏液分泌表型轉(zhuǎn)化的程度，而其可以用杯狀細(xì)胞面積與基底膜周長(zhǎng)(area/pbm)比值表示。

1.4 免疫熒光檢測(cè)

石蠟標(biāo)本經(jīng)脫蠟、水化后，用二抗相同宿主的血清(0.3 mol/mL甘氨酸+1% BSA+3%山羊血清)封閉30 min。加入稀釋的一抗(anti-α-SMA)，4 ℃孵育過(guò)夜。PBS洗3次，每次10 min。次日，加入1∶1 000稀釋過(guò)的偶聯(lián)熒光二抗。室溫下，暗盒中避光孵育1 h。PBS 洗5次，每次10 min。Gold Antifade Reagent with DAPI 封片過(guò)夜。借助于共聚焦激光共聚焦掃描、攝像并分析。采用ImageJ圖像分析軟件定量分析肺組織相關(guān)重塑指標(biāo)，氣道平滑肌的厚度以抗α-SMA陽(yáng)染的平滑肌層平均厚度表示，每個(gè)支氣管測(cè)量10個(gè)位置，每個(gè)切片至少測(cè)量10個(gè)支氣管。

1.5 小鼠氣道原代平滑肌細(xì)胞分離及表型標(biāo)志物蛋白水平檢測(cè)

取實(shí)驗(yàn)小鼠經(jīng)100% CO2吸入法處死。無(wú)菌條件下剪開(kāi)頸部，從環(huán)狀軟骨下2個(gè)氣管環(huán)取出氣管，放入加有100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素雙抗的含鈣HBSS中漂洗?？v向剪開(kāi)氣管體視顯微鏡下去除氣管周?chē)Y(jié)締組織和氣管內(nèi)、外膜。按照文獻(xiàn)[10]報(bào)道的“膠原酶消化法”分離小鼠原代氣道平滑肌細(xì)胞，取第4～7代的傳代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將PMSF與裂解液按照1∶100混合，每0.1克肺組織加入500 μL變性裂解液中，4 ℃，12 000 rpm/min離心10 min，蛋白濃度測(cè)定使用BCA試劑盒，并將各組蛋白總量調(diào)整為30 μg/μL。配制SDS PAGE膠，每個(gè)泳道加入等量蛋白進(jìn)行電泳分離，濕法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，使用5%脫脂牛奶封閉30 min后加入抗OPN、α-SMA、SM22α的單克隆抗體4 ℃過(guò)夜孵育。次日常溫下洗膜3次，加入二抗后孵育2 h。HRP-兔抗羊IgG室溫孵育2 h洗滌后于暗室中用ECL發(fā)光試劑顯影，檢測(cè)目標(biāo)蛋白。掃描膠片后用ImageJ軟件計(jì)算各蛋白條帶的灰度值，以相應(yīng)目的條帶與GAPDH的比值做統(tǒng)計(jì)分析。每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.6 小鼠氣道高反應(yīng)檢測(cè)

各組小鼠末次激發(fā)完成后，使用AniRes 2005 動(dòng)物肺功能儀檢測(cè)各組小鼠的氣道反應(yīng)性，具體操作流程如下：腹腔注射麻醉，后將小鼠仰臥位固定于操作臺(tái)上，眼科剪剪開(kāi)頸部皮膚，充分解剖暴露氣管及頸外靜脈；在環(huán)狀軟骨處剪開(kāi)一向心V型切口，沿該切口緩慢插入氣管套管于氣管內(nèi)，手術(shù)線(xiàn)固定氣管套管。氣管插管完畢后，經(jīng)頸外靜脈進(jìn)行穿刺，細(xì)線(xiàn)固定針柄，靜脈穿刺針尾部連接三通管，封閉儀器的體積描計(jì)箱。氣道反應(yīng)的激發(fā)步驟：通過(guò)與頸外靜脈穿刺針相通的三通管快速注入相應(yīng)濃度(0、10、20、40、80 μg/kg)的乙酰甲膽堿(Mch)溶液激發(fā)氣道反應(yīng)。不同濃度的Mch激發(fā)應(yīng)間隔3 min，并用PBS 沖洗三通管。同時(shí)記錄不同濃度乙酰甲膽堿激發(fā)后小鼠肺阻力變化的最高值代表氣道反應(yīng)性變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，非正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)(范圍)表示。多組間樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AG490干預(yù)對(duì)哮喘模型小鼠行為癥狀影響

各組小鼠在OVA致敏過(guò)程中行為基本無(wú)明顯異常，而哮喘組小鼠在霧化激發(fā)過(guò)程以及霧化結(jié)束一段時(shí)間內(nèi)，有抓臉抓鼻等瘙癢癥狀，同時(shí)表現(xiàn)有頻繁點(diǎn)頭等煩躁不安行為，且激發(fā)階段開(kāi)始后哮喘組小鼠進(jìn)食進(jìn)水量均有所減少，哮喘模型建立成功。正常對(duì)照組未見(jiàn)上述行為癥狀，進(jìn)食未見(jiàn)明顯減少。與哮喘組小鼠比較，AG490干預(yù)組小鼠亦存在抓臉抓鼻瘙癢癥狀，及頻繁點(diǎn)頭等煩躁不安行為，但是頻率和程度都較輕，表明采用AG490干預(yù)STAT3信號(hào)通路可緩解哮喘小鼠經(jīng)OVA激發(fā)期間出現(xiàn)的異常行為癥狀。

2.2 AG490干預(yù)STAT3信號(hào)對(duì)慢性哮喘小鼠氣道結(jié)構(gòu)改變的影響

HE染色行肺組織形態(tài)學(xué)觀(guān)察可見(jiàn)經(jīng)OVA致敏激發(fā)后哮喘組小鼠明顯氣道結(jié)構(gòu)病理改變，包括支氣管壁及血管周?chē)写罅垦装Y細(xì)胞浸潤(rùn)、杯狀細(xì)胞增生、氣管管腔狹窄等病理組織改變特征(圖1)。經(jīng)AG490干預(yù)后，小鼠肺組織中STAT3蛋白活化水平(p-STAT3/STAT3比值)得到顯著抑制[AG490干預(yù)組(0.46±0.22)vs.哮喘組(1.13±0.48)，P=0.121；AG490干預(yù)組(0.46±0.22)vs.正常對(duì)照組(1.55±0.37)，P=0.023](圖2)。AG490干預(yù)組小鼠氣道上皮下α-SMA陽(yáng)性面積顯著低于哮喘組[AG490干預(yù)組(1.56±0.24)vs.哮喘組(3.89±0.81)，P=0.011]及正常對(duì)照組[AG490干預(yù)組(1.56±0.24)vs.正常對(duì)照組(1.10±0.32)，P=0.012](圖3)。未觀(guān)察到AG490組小鼠上皮杯狀細(xì)胞增生與哮喘組相比存在顯著差異[AG490干預(yù)組(6.77±2.24)vs.哮喘組(7.49±1.89)，P=0.341](圖4)。

圖4 PAS染色觀(guān)察氣道上皮杯狀細(xì)胞化生情況

圖3 免疫熒光檢測(cè)拮抗STAT3信號(hào)通路對(duì)氣道平滑肌肥大的影響及量化分析

圖2 Western blot檢測(cè)各組小鼠肺組織中STAT3/p-STAT3蛋白表達(dá)水平

圖1 H&E染色觀(guān)察氣道壁增厚以及支氣管壁周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn)情況(×400)

2.3 AG490干預(yù)STAT3信號(hào)對(duì)模型小鼠氣道高反應(yīng)的影響

對(duì)各組小鼠進(jìn)行乙酰甲膽堿誘導(dǎo)氣道反應(yīng)性檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組小鼠相比，以濃度遞升的乙酰甲膽堿濃度激發(fā)時(shí)，哮喘組小鼠的肺阻力呈現(xiàn)增高的趨勢(shì)，且隨乙酰甲膽堿激發(fā)濃度不斷增高，OVA哮喘組小鼠氣道阻力呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性增高趨勢(shì)(圖5)。提取80 μg/kg 乙酰甲膽堿激發(fā)時(shí)各組實(shí)驗(yàn)小鼠肺阻力變化進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示與哮喘組相比，提前給予AG490干預(yù)可以顯著降低小鼠氣道反應(yīng)性的發(fā)生[AG490干預(yù)組(10.90±1.52)cm H2O·s/mLvs.哮喘組(13.99±2.52)cm H2O·s/mL，P=0.015]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 不同濃度乙酰甲膽堿刺激下各組小鼠氣道高反應(yīng)性變化(cm H2O·s/mL)

圖5 各組小鼠氣道高反應(yīng)性測(cè)定

2.4 AG490干預(yù)對(duì)氣道平滑肌表型標(biāo)志物蛋白表達(dá)的影響

用“膠原酶消化法”分離培養(yǎng)小鼠原代氣道平滑肌細(xì)胞，原代培養(yǎng)24 h后可見(jiàn)細(xì)胞貼壁伸展，培養(yǎng)2～3 d可見(jiàn)少量細(xì)胞貼壁伸展，15 d左右可進(jìn)行傳代。倒置顯微鏡下觀(guān)察傳代后細(xì)胞形態(tài)呈典型“峰谷”狀排列生長(zhǎng)，免疫熒光鑒定細(xì)胞表型，經(jīng)DAPI核染之后確定細(xì)胞純度在99%以上。采用免疫印跡方法檢測(cè)各組小鼠原代氣道平滑肌細(xì)胞收縮表型相關(guān)蛋白(α-SMA，SM22α)及合成表型相關(guān)蛋白(OPN)水平，結(jié)果顯示：與哮喘組相比，AG490干預(yù)組小鼠氣道平滑肌細(xì)胞收縮表型蛋白α-SMA[AG490干預(yù)組(1.09±0.32)vs.哮喘組(0.39±0.12)，P=0.002]和SM22α[AG490干預(yù)組(1.39±0.45)vs.哮喘組(2.59±0.34)，P=0.014]表達(dá)均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雖然觀(guān)察到AG490干預(yù)組小鼠OPN水平雖略有降低，但是與哮喘組相比，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[AG490干預(yù)組(0.45±0.21)vs.哮喘組(0.67±0.32)，P=0.232](圖6)。

圖6 Western blot方法檢測(cè)各組小鼠肺組織收縮表型和合成表型蛋白標(biāo)志物表達(dá)水平

3 討論

支氣管哮喘病理本質(zhì)是由多種細(xì)胞共同參與的慢性氣道性炎癥，主要以可逆性氣流受限和反復(fù)發(fā)作為特點(diǎn)，若治療不積極及時(shí)，可持續(xù)進(jìn)展出現(xiàn)氣道不可逆性的狹窄及氣道重塑等病理結(jié)構(gòu)性改變。

氣道重塑病理變化多樣，可表現(xiàn)為氣道上皮下纖維化，基底膜增厚，肌成纖維細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的聚集，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，平滑肌細(xì)胞增生肥厚，杯狀細(xì)胞增生等[11]。目前臨床一線(xiàn)激素抗炎治療對(duì)糾正氣道重塑的治療效果尚不理想，其根本原因在于現(xiàn)有對(duì)氣道重塑的發(fā)生機(jī)制理解尚不清楚。

STAT3屬于STATs家族的一員，介導(dǎo)細(xì)胞因子的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，經(jīng)細(xì)胞因子激活后的STAT3形成多聚體，然后入核結(jié)合調(diào)控細(xì)胞周期的基因啟動(dòng)子。已證實(shí)多種細(xì)胞周期蛋白是STAT3的直接作用底物，病理?xiàng)l件下STAT3信號(hào)通路的異常，是導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖活化重要機(jī)制之一[12]。不僅如此，研究表明在哮喘氣道炎癥中STAT3蛋白可通過(guò)調(diào)控T細(xì)胞分化方向，從而發(fā)揮其炎癥調(diào)節(jié)的作用。STAT3可通過(guò)介導(dǎo)IL-6免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)更多Th17細(xì)胞的分化成熟，在哮喘動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，哮喘組小鼠肺組織中STAT3與p-STAT3蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)，并且跟BALF中IL-6水平呈現(xiàn)正相關(guān)[13]。分離哮喘患者的支氣管黏膜組織檢測(cè)到其中p-STAT3蛋白水平顯著上升，進(jìn)一步分離支氣管上皮細(xì)胞經(jīng)塵螨變應(yīng)原(Derp1)刺激可顯著上調(diào)支氣管上皮細(xì)胞中p-STAT3的蛋白水平。反之，采用shRNA技術(shù)沉默胞內(nèi)STAT3信號(hào)可顯著抑制支氣管上皮細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子及細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少過(guò)敏原暴露誘發(fā)的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象[14]。上述研究結(jié)果提示STAT3信號(hào)通路在哮喘氣道炎癥中發(fā)揮重要調(diào)控作用，國(guó)際上已有應(yīng)用STAT3小分子抑制劑治療哮喘的研究報(bào)道發(fā)表[15]。但是，對(duì)于STAT3蛋白在哮喘氣道重塑中是否同樣具有重要作用尚不可知。氣道平滑肌細(xì)胞(airway smooth muscle cells, ASMCs)是氣道中數(shù)目最多和體積最大的細(xì)胞，其經(jīng)典作用是動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)氣道內(nèi)腔口徑和壁面硬度變化。最新的研究結(jié)果證實(shí)終末分化成熟的ASMCs亦具有較大的表型可塑性，異常表型轉(zhuǎn)換過(guò)程的發(fā)生可能是導(dǎo)致哮喘氣道重塑發(fā)生的重要機(jī)制之一[16-17]。通常狀態(tài)下ASMCs為收縮表型(contractile phenotype)，收縮反應(yīng)性強(qiáng)，胞內(nèi)主要表達(dá)平滑肌γ蛋白、平滑肌肌球蛋白重鏈以及鈣調(diào)蛋白等表型標(biāo)志物；但是在外界某種刺激條件下，ASMCs可向合成表型(synthesis phenotype)轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)為具有較強(qiáng)增殖能力和分裂能力，而收縮能力明顯降低，其主要標(biāo)記物包括骨架蛋白、非平滑肌肌漿球蛋白重鏈、波形蛋白等[18]。因此，異常ASMCs表型轉(zhuǎn)換過(guò)程的發(fā)生，一方面通過(guò)促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放和基質(zhì)蛋白在基底膜沉積，加劇了氣道炎癥的發(fā)生；另一方面又作為哮喘慢性持續(xù)化的組織改變基礎(chǔ)，加劇了氣道重塑過(guò)程的出現(xiàn)及惡化，ASMCs的表型轉(zhuǎn)換已成為未來(lái)氣道重塑研究的新熱點(diǎn)?；诖耍狙芯坷肑AK2/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的選擇性抑制劑AG490干預(yù)小鼠體內(nèi)STAT3信號(hào)活化后經(jīng)OVA致敏激發(fā)，結(jié)果顯示拮抗STAT3活化后不僅可有效抑制小鼠氣道平滑肌層增厚，與此同時(shí)還可以有效抑制小鼠氣道高反應(yīng)性的發(fā)生。國(guó)外學(xué)者Gavino等[19]也曾進(jìn)行過(guò)相似報(bào)道，采用小分子C188-9拮抗小鼠STAT3信號(hào)通路可以改善塵螨變應(yīng)原激發(fā)的哮喘小鼠炎癥反應(yīng)，包括抑制BALF中T相關(guān)細(xì)胞因子水平(IL-4、IL-5、IL-13、IL-17)以及肺組織中Th2/Th17細(xì)胞比例水平。此外，本研究體外分離小鼠原代氣道平滑肌細(xì)胞，采用免疫印跡方法檢測(cè)表型相關(guān)蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示與OVA哮喘組相比，AG490干預(yù)組小鼠氣道平滑肌細(xì)胞收縮表型蛋白水平(α-SMA, SM22α)均顯著降低，但是未觀(guān)察到合成表型相關(guān)蛋白OPN蛋白水平變化。本課題組研究結(jié)果提示：采用AG490拮抗小鼠STAT3信號(hào)通路活化可減輕OVA激發(fā)所致的氣道重塑及氣道高反應(yīng)性的發(fā)生，這可能與有效抑制氣道平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的發(fā)生有關(guān)。