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    免疫細胞化學p16/Ki-67雙染檢測對宮頸細胞學陰性且HR-HPV陽性病例的分流作用及組織學LSIL的轉歸預測價值

    2020-08-18 01:11:54邱曉陽王少洪王媛媛葉才果
    中國癌癥雜志 2020年7期
    關鍵詞:組織學細胞學亞型

    邱曉陽,王少洪,鄭 璟,吳 璇,王媛媛,劉 君,葉才果

    1.汕頭市中心醫(yī)院病理科,廣東 汕頭 515031;2.汕頭市中心醫(yī)院檢驗科,廣東 汕頭 515031;3.中山大學腫瘤防治中心病理科,廣東 廣州 510060;4.廣東醫(yī)科大學廣東省醫(yī)學分子診斷重點實驗室,廣東 東莞 523808

    宮頸癌是危害女性健康的第四大惡性腫瘤,全球每年宮頸癌的新發(fā)病例數(shù)大約為53萬例,中國的死亡病例數(shù)約為2.6萬例[1-2]。宮頸癌是目前唯一病因明確為人乳頭狀瘤病毒(human papilloma virus,HPV)感染,可通過開展合適的篩查,及早發(fā)現(xiàn)并有效降低發(fā)生率的癌癥[3]。對于30歲以上的已婚女性目前常用的聯(lián)合篩查策略是細胞學+高危型HPV(high-risk HPV,HR-HPV)檢測[4]。細胞學陰性、HR-HPV陽性是常見的聯(lián)合篩查異常結果,對于這種結果目前婦產(chǎn)科的處理流程是轉診陰道鏡。Sun等[5]和Liu等[6]研究發(fā)現(xiàn),平均隨訪2年,2.4%細胞學陰性、HR-HPV陽性患者為宮頸上皮內(nèi)瘤變2級(cervical intraepithelial neoplasia 2,CIN2)。Yang等[7]研究報道宮頸細胞學陰性且HR-HPV陽性3年CIN3+累積風險約為6.8%。顯而易見,過高的陰道鏡轉診率造成了大量的醫(yī)療資源浪費。目前對于組織學為低度鱗狀上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepithelial lesion,LSIL)的臨床處理共識是無需臨床手術或藥物治療,僅需追蹤隨訪[8]。Segura等[9]針對一項大樣本量的初次陰道鏡組織學LSIL患者隨訪1年,有65%的患者自然消退,20%的患者病變持續(xù),但仍然有15%的患者病變進展。因此,尋找一種客觀的分子指標來指導細胞學陰性、HR-HPV陽性患者進行分流管理,明確組織學LSIL患者宮頸病變風險,是臨床迫切需要解決的問題。本研究擬為尋找一種對宮頸細胞學陰性且HR-HPV陽性患者具有分流作用及組織學LSIL患者轉歸具有預測價值的生物學指標提供實驗依據(jù)。

    1 資料和方法

    1.1 標本來源

    收集2017年4月—2018年7月于汕頭市中心醫(yī)院和中山大學腫瘤防治中心經(jīng)宮頸篩查細胞學陰性且HR-HPV陽性的708例已婚女性患者為研究對象,患者均進行了初次陰道鏡檢查并在宮頸脫落細胞標本中完成了p16/Ki-67雙染檢測,患者年齡30.6~78.5歲,平均年齡(41.3±9.6)歲。對初次陰道鏡病理學檢查結果為LSIL的患者隨訪1年,每6個月使用細胞學+HR-HPV篩查1次,除細胞學和HR-HPV陰性檢測結果外,其他再行陰道鏡活檢術,取活體組織進行病理學檢查的病例59例。研究對象的納入標準:①非妊娠期;② 非生理期;③無宮頸疾病治療史;④ 無免疫系統(tǒng)疾??;⑤ 簽署知情同意書。

    1.2 試劑與儀器

    免疫細胞化學法p16/Ki-67雙染檢測試劑盒(包含雙染試劑盒專用抗原修復液、內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑、即用型組合一抗、即用型酶標第二抗體、顯色劑、蘇木精染色液。備案號:閩榕械備20180037號)購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。HB-300C HPV化學發(fā)光免疫分析儀購自嘉興科瑞迪醫(yī)療器械有限公司。HPV核酸檢測試劑盒購自杭州德同生物技術有限公司。ThinPrep2000細胞學制片儀購自北京豪洛捷醫(yī)療科技有限公司。

    1.3 宮頸細胞學標本制備

    在ThinPrep2000細胞學制片儀中,按儀器說明書操作規(guī)程制作細胞學薄片,將細胞學薄片固定于95%乙醇中30 min、巴氏染色,由2名資深病理科醫(yī)師進行診斷,診斷術語參考最新的細胞學TBS分類系統(tǒng)[10]。文中細胞學陰性指細胞學結果<非典型鱗狀上皮細胞(atypical squamous cells of undetermined significance,ASCUS)。

    1.4 宮頸組織學標本制作

    宮頸組織放入4%甲醛溶液中固定,經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、裱片、蘇木精-伊紅染色等步驟完成石蠟切片制作。由2名資深病理科醫(yī)師進行確診,依據(jù)為《世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)女性生殖器官腫瘤學分類(第4版)解讀》[11]。文中LSIL指CIN1。

    1.5 p16/Ki-67雙染檢測流程及判讀標準

    1.5.1 p16/Ki-67雙染檢測流程

    細胞固定(宮頸細胞薄片置于95%乙醇中,浸泡30 min)、抗原修復(抗原修復液隔水加熱至95 ℃,修復20 min,自然冷卻,磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS)沖洗3 min×2次)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶(加100 μL H2O2,室溫下溫育10 min,PBS沖洗3 min×3次)、加即用型組合一抗(加100 μL一抗,室溫下溫育60 min,PBS沖洗3 min×3次)、加即用型酶標第二抗體(加100 μL二抗,室溫下溫育15 min,PBS沖洗3 min×3次)、加顯色液A(加100 μL顯色劑A,顯色10~15 min,PBS沖洗3 min×3次)、加顯色液B(加100 μL顯色劑B,顯色5 min,流水沖洗終止顯色)、復染(加100 μL蘇木精染色液20 s,流水沖洗,PBS沖洗返藍,流水沖洗)、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

    1.5.2 p16/Ki-67判讀標準

    陽性結果指細胞薄片中同一個細胞內(nèi)細胞質(zhì)呈紅色著色(p16染色陽性)且細胞核呈棕黃色著色(Ki-67染色陽性),陰性結果指細胞薄片中僅為細胞核有蘇木精襯染的淺藍色,或細胞質(zhì)呈紅色著色(p16染色陽性),亦或細胞核呈棕黃色著色(Ki-67染色陽性)[12-13]。

    1.6 HPV檢測及判讀標準

    HPV DNA檢測采用的是雜交捕獲-化學發(fā)光法,檢測原理為:樣本中的HPV病毒雙鏈DNA變性解開成單鏈,單鏈DNA與特異性RNA探針結合為DNA-RNA雜合體,DNA-RNA雜合體與捕獲微孔板上的特異性抗體結合固定在捕獲微孔板上,再與偶聯(lián)有堿性磷酸酶的抗DNA-RNA雜合體的特異性抗體結合,酶促化學發(fā)光,檢測樣本中的HPV DNA含量。參照試劑說明書,檢測過程為變性、雜交、捕獲、檢測、洗板、化學發(fā)光等步驟。該試劑盒用于體外定性檢測子宮頸脫落細胞樣本中的2種(HPV16、18型)和12種(HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68型)HPV的核酸。所有的檢測均以樣本測量值/參考值的比值表示,比值≥1.0,結果為“陽性”;比值<1.0,結果為“陰性”。

    1.7 HPV感染亞型的分組

    根據(jù)HPV感染亞型的不同,分為3組。第1組,HPV其他12亞型組(限于HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68亞型中有一個亞型以上為陽性結果即納入本組中),患者年齡30.9~72.3歲,平均年齡(42.6±8.7)歲。第2組,HPV16/18亞型組(限于HPV16或18亞型中有一個亞型以上為陽性結果即納入本組中),患者年齡30.6~76.9歲,平均年齡(40.5±10.1)歲。第3組,同時陽性組(HPV16/18亞型組+HPV其他12亞型組同時陽性才納入本組中)?;颊吣挲g32.3~78.5歲,平均年齡(41.8±9.3)歲。3組間年齡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

    1.8 宮頸組織學LSIL病變的轉歸分類

    初次陰道鏡組織學檢查結果為LSIL的轉歸包括3種情況。第1種情況,再次組織學檢查結果低于LSIL的患者為消退。第2種情況,再次組織學檢查結果維持LSIL的患者為持續(xù)。第3種情況,再次組織學檢查結果高于LSIL,包括CIN2、CIN3和宮頸癌的患者為進展。

    1.9 統(tǒng)計學處理

    采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理。計數(shù)資料:率的比較、靈敏度和特異度的比較采用χ2檢驗。計量資料的比較采用方差分析。靈敏度是指由組織學診斷為陽性的病例中,經(jīng)p16/Ki-67雙染檢測為陽性例數(shù)的比例。特異度是指由組織學診斷為陰性的病例中,經(jīng)p16/Ki-67雙染檢測為陰性例數(shù)的比例。符合率是指p16/Ki-67雙染檢測中真陽性和真陰性之和占總受檢人數(shù)的比例。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 p16/Ki-67雙染的圖像

    生物顯微鏡下的細胞學薄片中,宮頸鱗狀上皮細胞p16/Ki-67雙染的圖像分為兩類。一類為p16/Ki-67雙染陰性,包括:①p16/Ki-67染色均為陰性(僅為細胞核有蘇木精襯染的淺藍色);② p16單染色陽性(細胞質(zhì)呈紅色著色);③Ki-67單染色陽性(細胞核呈棕黃色著色)。另一類為p16/Ki-67雙染陽性(同一個細胞內(nèi)細胞質(zhì)呈紅色著色且細胞核呈棕黃色著色,圖1)。

    圖1 p16/Ki-67雙染的圖像Fig.1 p16/Ki-67 double dye image

    2.2 p16/Ki-67雙染陽性與初次陰道鏡組織病理學檢查結果的關系

    708例就診患者中有165例患者p16/Ki-67雙染陽性,雙染陽性率為23.31%(165/708)。543例患者p16/Ki-67雙染陰性,雙染陰性率為76.69%(543/708)。在初次進行陰道鏡組織病理學檢查的223例患者中,p16/Ki-67雙染陽性患者有12例患者為CIN2,41例患者為CIN3,2例患者為宮頸癌。p16/Ki-67雙染陰性患者有4例患者為CIN2,2例患者為CIN3。p16/Ki-67雙染陽性患者中CIN2+的發(fā)生率[33.33%(55/165)]與p16/Ki-67雙染陰性患者中CIN2+的發(fā)生率[1.10%(6/543)]相比差異有統(tǒng)計學意義(χ2=166.94,P<0.001)。p16/Ki-67雙染陽性患者中CIN3+的發(fā)生率[26.06%(43/165)]與p16/Ki-67雙染陰性患者中CIN3+的發(fā)生率[0.37%(2/543)]相比差異有統(tǒng)計學意義(χ2=140.35,P<0.001)。

    2.3 p16/Ki-67雙染檢測診斷HR-HPV陽性而液基薄層細胞學檢查(thinprep cytology test,TCT)陰性患者的CIN2/CIN3效能

    針對本研究中HR-HPV陽性而TCT陰性的患者,以初次組織病理學檢查結果為金標準,p16/Ki-67雙染診斷該群體患者的CIN2/CIN3整體效能較高。p16/Ki-67雙染對該群體患者的CIN2+和CIN3+病變診斷的靈敏度、特異度和符合率之間差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05,表1)。

    表1 p16/Ki-67雙染檢測診斷HR-HPV陽性而TCT陰性患者的CIN2/CIN3效能Tab.1 Efficacy of p16/Ki-67 double staining in the diagnosis of CIN2/CIN3 in HR-HPV positive but TCT negative patients (n)

    2.4 p16/Ki-67雙染陽性率在不同HPV亞型感染組之間的差異

    708例就診患者中,HPV其他12亞型組、HPV16/18亞型組、同時陽性組所占的比例分別為71.89%(509/708)、20.76%(147/708)、7.34%(52/708)。3組對應的p16/Ki-67雙染陽性率分別為18.66%(95/509)、29.25%(43/147)、51.92%(27/52)。上述3組的陽性率經(jīng)χ2趨勢檢驗分析,有遞增趨勢(趨勢χ2=29.119,P<0.001)。且3組間p16/Ki-67雙染陽性率總體差異有統(tǒng)計學意義(χ2=32.869,P<0.001)。進一步進行兩兩比較,同時陽性組的p16/Ki-67雙染陽性率分別與HPV其他12亞型組(χ2=30.668,P<0.001)、HPV16/18亞型組(χ2=8.658,P=0.003)相比差異均有統(tǒng)計學意義。HPV16/18亞型組的p16/Ki-67雙染陽性率與HPV其他12亞型組相比差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.697,P=0.006)。

    2.5 不同p16/Ki-67雙染表達對組織學LSIL患者轉歸的預測價值

    對初次陰道鏡活檢術組織病理學檢查結果為LSIL的患者進行隨訪1年,每6個月使用細胞學+HR-HPV進行篩查1次,除細胞學和HPV陰性檢測結果外,其他均再次行陰道鏡活檢術,必要時再次取活檢病理學檢查的病例59例。8例LSIL病變進展的患者中,有6例p16/Ki-67雙染陽性,2例p16/Ki-67雙染陰性,p16/Ki-67雙染陽性診斷LSIL病變進展率是p16/Ki-67雙染陰性的3倍。22例LSIL病變持續(xù)的患者中,有12例p16/Ki-67雙染陽性,10例p16/Ki-67雙染陰性,p16/Ki-67雙染陽性診斷LSIL病變持續(xù)率是p16/Ki-67雙染陰性的1.2倍。29例LSIL病變消退的患者中,有3例p16/Ki-67雙染陽性,26例p16/Ki-67雙染陰性。

    3 討 論

    中國35~64歲的適齡女性需要接受宮頸癌篩查人數(shù)約3億[14]。2009—2017年累計篩查人數(shù)約為7 000萬,占實際需要篩查人數(shù)的23.33%[15]。面對數(shù)量龐大的篩查人群,準確、簡便、高效的篩查手段顯得尤為重要。當前,細胞學聯(lián)合HRHPV檢測是篩查宮頸癌的共識。但是,細胞學篩查面臨的問題在于主觀性強,依賴病理科醫(yī)師的經(jīng)驗,靈敏度較低,容易出現(xiàn)漏診。HPV檢測無法區(qū)分一過性感染和轉化型HPV感染。細胞學陰性、HR-HPV陽性的篩查結果是臨床常見的異常類型。從邏輯上說,只有HPV感染持續(xù)才會有細胞學陽性,HPV感染首先發(fā)生細胞學的變化,但是過高的HPV一過性陽性反而增加了患者的心理壓力,且細胞學取材具有局限性,還與操作者和閱片者水平差異相關,漏診的情況時有發(fā)生。目前臨床上對于細胞學陰性、HR-HPV陽性患者的處理,大量陰道鏡轉診容易造成過度醫(yī)療,而對于組織學LSIL尚缺乏早期風險預測指標。因此,尋找一種客觀的能用于對細胞學陰性、HR-HPV陽性患者的分流管理,明確組織學LSIL宮頸病變風險的生物學指標具有重要的臨床價值。

    p16蛋白是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑[16]。p16過表達提示宮頸細胞處于細胞周期的阻滯期。Ki-67標記指數(shù)反映細胞周期進展及增殖活躍[17]。Ki-67染色陽性提示宮頸細胞處于細胞周期的增殖期。p16和Ki-67同時陽性,則提示細胞周期調(diào)控失調(diào)。正常生理狀態(tài)下,p16和Ki-67的表達相互制約,達到一種動態(tài)平衡的狀態(tài),且不會同時出現(xiàn)于同一個細胞中。

    通過本文p16/Ki-67雙染表達與初次陰道鏡組織病理學檢查結果的實驗數(shù)據(jù),進一步驗證了p16/Ki-67雙染檢測可作為細胞周期失調(diào)的標志物,有助于識別病變細胞。與Van Zummeren等[18]認為的p16與Ki-67雙染可獨立于形態(tài)學找出“癌變”細胞的研究觀點相一致。

    盡管根據(jù)《WHO女性生殖器官腫瘤學分類(第4版)解讀》[11],CIN被分為LSIL和高度上皮內(nèi)瘤變(high-grade intraepithelial neoplasia,HSIL)。由于《中國子宮頸癌篩查及異常管理相關問題專家共識(二)》[8]指出CIN2中的p16/Ki-67雙染陰性的患者仍然歸屬于LSIL。為了更精準地與婦科診治工作相結合,本文仍然進一步把HSIL細分為CIN2和CIN3,分別進一步觀察了p16/Ki-67雙染檢測對HR-HPV陽性而TCT陰性患者的CIN2/CIN3診斷效能。本研究結果顯示,當p16/Ki-67檢測陽性時,可強烈提示高級別病變,為區(qū)分潛在高級別病變提供了客觀的檢測指標,與許淑霞等[19]的研究結論相同。

    文中p16/Ki-67雙染陽性率在不同亞型HPV感染組之間的差異,可反映p16/Ki-67雙染陽性率與不同亞型HPV感染組的相關性。尤其是對于同時陽性組和HPV16/18亞型組的患者應高度重視,謹慎處理,密切隨訪,與Rodríguez-Trujillo等[20]和王海瑞等[21]研究認為的p16/Ki-67雙染陽性在HPV16/18婦女進展為HSIL/CIN2+和HRHPV持續(xù)存在的風險很高的研究結論基本一致。

    盡管約65%的LSIL會自然消退,臨床上可僅觀察隨訪[22]。但是對于15%的宮頸病變可能進展的患者的預測價值仍然值得重視。本研究從不同的p16/Ki-67雙染結果探討了組織學LSIL患者的轉歸,發(fā)現(xiàn)p16/Ki-67雙染陰性患者的轉歸結局優(yōu)于p16/Ki-67雙染陽性的患者。因此,對于p16/Ki-67雙染陽性的患者,臨床上應重點關注,注意運用多學科進行排查,密切追蹤復查,及時預測和發(fā)現(xiàn)HSIL等病變,做到早診斷、早治療。本研究結論與王宇華等[23]報道的p16/Ki-67有利于預警宮頸病變轉歸的觀點一致。

    p16/Ki-67雙染檢測作為新興的宮頸癌篩查技術,取材方式無創(chuàng),患者依從性好;判讀客觀明確,可減輕診斷醫(yī)師的閱片負擔;實驗過程無需特殊的儀器,可降低運行的成本,適合在各個層級的醫(yī)院開展,尤其適用于欠發(fā)達地區(qū)的宮頸癌篩查。本研究結果顯示,p16/Ki-67雙染檢測對于甄別HR-HPV陽性而TCT陰性患者的CIN2/CIN3具有較高的靈敏度和特異度,能夠彌補細胞學檢查靈敏度的不足,減少漏診,可明確宮頸病變風險,為臨床上宮頸細胞學陰性且HR-HPV陽性的檢測結果提供分流管理指導,對于組織學結果為LSIL的患者轉歸也具有較好的預測價值,具有在臨床上推廣使用的潛能。

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