Fe3O4納米酶對白念珠菌的體外抑制實驗研究

王昊玨 房靈 崔成軍 施啟豐 陸勝 陸顯義 高利增

1無錫市錫山人民醫(yī)院婦產(chǎn)科214105；2無錫市錫山人民醫(yī)院皮膚科214105；3無錫市錫山人民醫(yī)院病理科214105；4無錫市錫山人民醫(yī)院檢驗科214105；5揚州大學轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究院225012

納米酶是具有類酶催化活性的納米材料，屬于新一代人工模擬酶。具有過氧化物酶或氧化酶活性的納米酶可以抑制多種細菌如大腸桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和變形鏈球菌的生長［1-2］。我們之前的工作發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e3O4納米酶具有過氧化物酶活性，可以分解H2O2生成自由基，在酸性條件下，通過誘導高水平的活性氧（ROS），殺死細菌，破壞生物膜的形成［3］，有望作為一種新型的抑菌制劑。本研究觀察Fe3O4納米酶對體外白念珠菌的作用，以期為白念珠菌感染的治療提供新的選擇。

一、材料與儀器

氯化鐵、葡萄糖、瓊脂、蛋白胨、聚乙二醇、乙二醇（美國Sigma公司），醋酸鈉、戊二醛、30%H2O2［生工生物工程（上海）股份有限公司］。白念珠菌標準株（編號：AF206001，批號：20170721）購自武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

二、方法

1.納米酶的制備與表征：以水熱合成法［4-6］為基礎(chǔ)，適當改進后制備Fe3O4納米酶。取0.82 g 無水氯化鐵溶于40 ml乙二醇和聚乙二醇（1∶3）溶液中，緩慢加入3.6 g 三水醋酸鈉，快速攪拌，形成均勻懸濁液，超聲震蕩，充分混勻。將溶液轉(zhuǎn)移至50 ml聚四氟乙烯反應(yīng)釜，于200 ℃下加熱12 h，自然冷卻至室溫后，得到黑色沉淀物。采用乙醇和水分別洗滌產(chǎn)物3 次，于60 ℃干燥3 h 得到Fe3O4納米顆粒。取適量Fe3O4納米顆粒均勻分散在水溶液中，滴加于硅片上，常溫干燥后，掃描電鏡和透射電鏡觀察形貌。

2.白念珠菌培養(yǎng)及處理：配制沙氏固體培養(yǎng)基（含蛋白胨、瓊脂、葡萄糖）、沙氏液體培養(yǎng)基（含蛋白胨、葡萄糖）。采用沙氏液體培養(yǎng)基稀釋50 μl白念珠菌菌液至5 ml，37 ℃震蕩培養(yǎng)24 h，使用沙氏液體培養(yǎng)基稀釋菌液至106CFU/ml作為標準菌懸液備用。根據(jù)本課題組前期實驗基礎(chǔ)［4］，采用0.5 g/L Fe3O4納米酶和0.1%H2O2與菌液共培養(yǎng)，分為納米酶組、H2O2組、聯(lián)合組（納米酶+H2O2共處理），以未做處理菌液為對照組。

3.納米酶對白念珠菌生長的抑制作用：挑取4 組白念珠菌單克隆接種于5 ml 沙氏培養(yǎng)液，恒溫搖床震蕩培養(yǎng)過夜。1∶100轉(zhuǎn)接，每隔2 h檢測600 nm處吸光度（A值），繪制白念珠菌生長曲線。每次設(shè)置3個平衡，取平均值。

4.納米酶對體外白念珠菌生長的影響：采用平板稀釋法，取4 組菌液于4 只1.5 ml 無菌EP 管，處理2 h 后10 倍稀釋，混勻涂板，于36 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落形成情況并計數(shù)。抑菌率=（對照組菌落數(shù)-實驗組菌落數(shù)）/對照組菌落數(shù)×100%。實驗重復3次。

5. 掃描電鏡觀察納米酶對白念珠菌形態(tài)的影響：取4 組經(jīng)過處理2 h后的菌液5 ml，4 000 r/min離心（離心半徑6 cm）3 ～5 min，生理NaCl溶液清洗3遍，棄上清液，2.5%戊二醛固定，于4 ℃冰箱中固定2 h 以上，生理NaCl 溶液沖洗2 ～3遍。采用梯度濃度的乙醇溶液脫水，經(jīng)干燥、黏樣、噴金導電后，采用掃描電鏡觀察、拍照。

6. 統(tǒng)計學方法：采用GraphPad Prism7 軟件，計量資料采用±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

三、結(jié)果

1.Fe3O4納米酶的形態(tài)：透射電鏡下觀察到大量單個分散的黑色納米酶顆粒，大致呈圓形，表面有大小一致的小突起，粒徑均勻，平均直徑約120 nm。見圖1。

2.納米酶對白念珠菌生長的影響：白念珠菌前22 h 處于生長的穩(wěn)定期，22 h后進入對數(shù)生長期，36 h時進入平臺期。聯(lián)合組白念珠菌前2 h有生長，后均受到抑制。見圖2。

對照組、H2O2組、Fe3O4納米酶組、聯(lián)合組的菌落計數(shù)分別為124 830 ± 45 170、86 330 ± 13 960、91 670 ± 31 370、30 330±3 010，差異有統(tǒng)計學意義（F=9.41，P ＜0.05），聯(lián)合組低于對照組、H2O2組、納米酶組（t=4.63、8.08、4.27，P ＜0.05），H2O2組、納米酶組和對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（t=1.82、1.34，P ＞0.05）。

H2O2組、納米酶組、聯(lián)合組的抑菌率分別為30.84% ±5.00%、26.57%±11.24%、75.70%±2.42%，差異有統(tǒng)計學意義（F=9.413，P=0.0004），聯(lián)合組抑菌率高于H2O2組、納米酶組，差異有統(tǒng)計學意義（t=8.08、4.27，P ＜0.05）；H2O2組與納米酶組差異無統(tǒng)計學意義（t=0.35、4.27，P=0.74）。

3.納米酶對白念珠菌形態(tài)的影響：處理2 h后掃描電鏡觀察，對照組白念珠菌菌體飽滿，可見出芽生殖；H2O2組、Fe3O4納米酶組可見菌體稍皺縮；聯(lián)合組菌體明顯變形、崩解。見圖3。

四、討論

圖1 電鏡下納米酶顆粒形態(tài) 1A：掃描電鏡下為單個分散的黑色納米酶顆粒，大致呈圓形，尺寸均一（×4 000）；1B：透射電鏡下平均直徑為120 nm的顆粒，表面有大小一致的小突起（×5 000）

圖2 不同處理條件下白念珠菌生長曲線 對照組白念珠菌前22 h處于生長的穩(wěn)定期，22 h后進入對數(shù)生長期，36 h時進入平臺期。納米酶組、H2O2組、聯(lián)合組白念珠菌的生長均受到抑制

圖3 掃描電鏡觀察各組白念珠菌形態(tài) 3A：對照組見白念珠菌細胞呈圓形或卵圓形，可見出芽，直徑3 ～6 μm；3B：H2O2組見菌絲萎縮，活性減退；3C：納米酶組見菌絲進一步萎縮，活性減退；3D：聯(lián)合組見菌絲裂解成碎屑狀

納米酶是一類新型的模擬酶，有特殊的抗菌作用。3% H2O2是常用的殺菌消毒劑，它能分解產(chǎn)生自由基，破壞細菌的細胞膜、蛋白質(zhì)、核酸等活性組分，H2O2酶可加速產(chǎn)生自由基的效率。具有過氧化物模擬酶活性的納米材料就可有類似作用，提高H2O2產(chǎn)生自由基的效率，增強殺菌消毒的效果［7］。Falsetta 等［8］發(fā)現(xiàn)，納米鐵能損毀細菌生物膜，對口腔內(nèi)耐藥細菌具有較好的抑制作用，并在酸性環(huán)境中（pH 4.5 ～4.7）更加有效。在低濃度H2O2存在時，微量的納米酶即可殺滅100%大腸桿菌，而單獨使用H2O2殺菌效率低于15%［9］。

本研究采用水熱合成法制備Fe3O4納米酶顆粒，電鏡下觀察到Fe3O4納米酶大致呈圓形，表面有大小一致的小突起，粒徑均勻，平均直徑約120 nm，將其聯(lián)合H2O2作用于體外培養(yǎng)的白念珠菌，計算其抑菌率，并在電鏡下觀察白念珠菌形態(tài)。結(jié)果顯示，對照組白念珠菌具有相對穩(wěn)定的生存曲線，而納米酶組、H2O2組、聯(lián)合組白念珠菌的生長均受到抑制，單用H2O2或納米酶對白念珠菌的抑菌率為30%左右，而聯(lián)合組可達75.70%，抑菌效力明顯增強。電鏡下觀察4 組白念珠菌的形態(tài)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過Fe3O4納米酶、H2O2作用的白念珠菌活性減退，而聯(lián)合組白念珠菌發(fā)生了崩解，提示Fe3O4納米酶聯(lián)合H2O2具有較強的抗白念珠菌能力。

基于本試驗結(jié)果，F(xiàn)e3O4納米酶可能會成為一種全新的不同于其他藥物的抗菌制劑，從而用于白念珠菌感染的治療。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突