基于TP0136蛋白異質(zhì)性建立一種新的蒼白密螺旋體分子分型方法

魏然 柯吳堅 陳文韜 譚玲俏 劉雅慧 呂萍 黃濤張君 張曉輝 王柳苑 車雅敏

1天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院皮膚性病科300052；2南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院皮膚二科，廣州510091；3陽江市公共衛(wèi)生醫(yī)院皮膚性病科，廣東529500；4清遠(yuǎn)市慢性病防治醫(yī)院皮膚性病科，廣東511500

密螺旋體屬（Treponema pallidum，TP）包括雅司蒼白密螺旋體（Treponema pallidum ssp.Pertenue，TPE）、未分類的類人猿密螺旋體（Fribourg-Blanc，F(xiàn)B）、地 方 密 螺 旋 體（Treponema pallidum ssp.endemicum，TEN）、梅毒蒼白密螺旋體（Treponema pallidum ssp. Pallidum，TPA）等。雅司病的病原體TPE、地方性梅毒的病原體TEN 與FB 的基因組具有高度親緣性，且雅司病的臨床癥狀與血清學(xué)檢測特征難以和梅毒區(qū)分［1-2］。因此尋找一種合適的TP分型方法，對TP 的分子流行病學(xué)研究和臨床防治十分關(guān)鍵。

既往研究顯示，TPA基因亞型與毒力、耐藥性、病期的發(fā)展轉(zhuǎn)歸等具有密切關(guān)系［3］?，F(xiàn)有的TPA酸性重復(fù)蛋白（acidic repeat protein，Arp）/重復(fù)基因（T.pallidum repeat gene，Tpr）雙基因分型方法［4］和Arp/Tpr/TP0548 三基因聯(lián)合分型法［3］具有結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好的特點，適用于多種來源的臨床樣本，目前被普遍采用。然而，我國高達88%的TPA株為14D/f 亞型，無法得到進一步區(qū)分，因此現(xiàn)有的雙/三基因分型方法均不適用于我國梅毒流行株的研究［1，3，5］。近年來研究者對多個可變位點進行分析，試圖選取TP0279、TP0558 、TP0326 等新的基因位點用于臨床鑒別，但分型效率均不理想［5-6］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，在TP 不同菌種和TPA 不同菌株中TP0136存在基因異質(zhì)性［7］。利用這一特點，我們通過研究TP0136蛋白在TPA、TPE、FB和TEN 各種之間的異質(zhì)性，建立一種新的TP分子分型方法。

材料與方法

1.主要試劑與儀器：梅毒螺旋體明膠凝集試驗（TPPA）試劑盒（日本富士瑞必歐株式會社），甲苯胺紅不加熱血清試驗（TRUST）試劑盒（上海榮盛生物技術(shù)有限公司），QIAamp DNA Mini 試劑盒（德國Qiagen公司），T100PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

2.標(biāo)本收集及DNA提?。?015年1月至2018年12月在廣東省南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院性病門診收集23 例梅毒患者。所有患者TRUST 和TPPA 血清檢測結(jié)果均為陽性。根據(jù)梅毒分期，采集受試者1 ～3 種標(biāo)本：①抽取靜脈血2 ml，置于促凝管內(nèi)；②行腰椎穿刺術(shù)收集1 ml腦脊液于無菌管中；③用生理氯化鈉溶液清洗硬下疳表面，以鈍刀輕輕刮取受試者皮損表面并擠壓以收集滲出液。將23例的臨床樣本以GD001-GD023編號。將0.5 ml血液、腦脊液或硬下疳滲出液與0.5 ml 2×細(xì)胞裂解液緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，0.2 mol/L 乙二胺四乙酸，1%十二烷基硫酸鈉）充分混勻，應(yīng)用QIAamp DNA Mini 試劑盒（德國Qiagen 公司）嚴(yán)格按照說明書提取23例患者的DNA，凍存于-20 ℃。本研究已取得廣東省南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

3. TP0136 序列分析和引物設(shè)計：從GenBank中查詢TP0136 氨基酸和核酸序列，對9 株TPA（Nichols Houston、Nichols Seattle、Nichols Dallas、DAl-1、Bal73-1、Seattle81-4、Chicago、MexicoA 和SS14）、3 株TPE（Samoa D、CDC2 和Gauthier）、1 株FB 和1 株TEN（Bosnia A）進行氨基酸序列多重比對，采用BioEdit 7.1 軟件分析。應(yīng)用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計TP0136 開放閱讀框（ORF）引物。假定的裂解信號肽位于分泌蛋白的N端，一般由15 ～30 個氨基酸組成，在信號肽越膜進入膜外時可被信號肽酶水解，因此ORF 應(yīng)不含信號肽。用SignalP 4.1 Server 軟件預(yù)測TP0136 信號肽，TP0136 的ORF 引物不含信號肽。由于TP0136 蛋白羧基端存在差異，本研究共設(shè)計兩對不同引物以對應(yīng)菌株TP0136 蛋白的不同羧基端編碼序列。Tp0136基因第1對引物：正向5′-ATGACGTGCGAT TTCACTGG-3′，反向5′-CTC GCGGTTCCAGGAGCA CG-3′，擴增產(chǎn)物大小為1 389 bp，目的菌株為Nichols Houston、Bal73-1、Seattle81-4、Chicago、MexicoA SS14；第2 對引物：正向5′-ATGACGTGCG ATTTCACTGG-3′，反向5′-ACTACGTAGATTTTCTG CAC-3′，擴增產(chǎn)物大小為1 260 bp，目的菌株為Nichols Seattle、DAl-1、Nichols Dallas。

4.PCR 擴增TP0136 基因：常規(guī)PCR 擴增23 株臨床分離株TP0136 基因。50 μl PCR 反應(yīng)體系含5 μl 待測DNA 樣本、4 μl 200 μmol/L dNTPs、5 μl 10×Go Taq PCR 緩沖液（美國Promega 公司）、3 μl 1.5 mmol/L MgCl2、3 μl 0.6 μmol/L TP0136 引物、0.5 μl 熱啟動Taq PCR 聚合酶（美國Promega 公司）等。擴增條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性1 min、60 ℃退火2 min、72 ℃延伸1 min，共45 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴增PCR 產(chǎn)物經(jīng)15 g/L 瓊脂糖凝膠電泳鑒定。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)ExoSAP-IT PCR產(chǎn)物純化試劑盒（美國Affymetrix公司）純化回收處理后，應(yīng)用雙向DNA 測序法［生工生物工程（上海）股份有限公司］對23 株TPA 的ORF 進行測序。

5.TPA 三基因聯(lián)合分型法：將TPA Arp 基因重復(fù)序列的數(shù)目、Tpr 經(jīng)MseⅠ酶切后限制性片段長度多態(tài)性的型別和TP0548基因序列的型別進行聯(lián)合，建立以Arp/Tpr/TP0548為核心的三基因分型方法。參考文獻［8］通過PCR 擴增TPA 菌株Arp 基因、Tpr基因、TP0548基因，使用凝膠電泳分析軟件分析Arp 基因60 個堿基對的重復(fù)序列數(shù)目，并與含有14 個重復(fù)序列的Nichols 標(biāo)準(zhǔn)株進行比較，將菌株分為“2 ～22”型別；將TprⅡ基因經(jīng)MseⅠ酶切后進行限制性片段長度多態(tài)性分析，與文獻［9］報道的“A ～P”型別進行比較；純化后的TP0548 基因PCR 產(chǎn)物經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司測序后，將測序結(jié)果用BioEdit7.1 軟件與“a ～i”型別進行比較［3-4］。

結(jié) 果

1.14株TP TP0136序列分析結(jié)果：見表1、圖1。多重序列比對結(jié)果顯示，14株TP的TP0136氨基酸編碼序列存在大量基因插入、缺失等情況，表明TP0136存在高度異質(zhì)性。以序列中至少出現(xiàn)一個氨基酸差異作為分型標(biāo)準(zhǔn)對這些TP株分型，其中，3 株TPE 的TP0136 氨基酸序列各不相同，分為3 型，以Ⅰ～Ⅲ型別表示；TEN（Bosnia A）可與TPE、TPA 顯著區(qū)分，以Ⅳ型表示；9 株引起人類性病的TPA 分為6 型，以Ⅴ～Ⅹ型別表示。除TPE 中的CDC2 和FB 無法完全區(qū)分外，其他TPE 和FB 菌株均可區(qū)分。從第100 位氨基酸起，Ⅰ～Ⅲ型差異明顯，Samoa D株在第108位是異亮氨酸，而CDC2、FB和Gauthier 株是絲氨酸；Gauthier 株在第166 位與CDC2株、FB株相比缺少絲氨酸。TPA中的Ⅴ型較Ⅵ型菌株缺少1 組重復(fù)序列；Dal-1 和Nichols Seattle 株的TP0136 氨基酸序列完全一致，分為Ⅵ型；Nichols Houston、Chicago 和Bal73-1 株 的TP0136 氨基酸序列完全一致，分為Ⅶ型；其他3 株（Seattle 81-4、SS14、MexicoA）的TP0136 氨基酸序列各不相同，以Ⅷ～Ⅹ型別表示。

表1 14株密螺旋體分型情況

2. 23 株TPA 菌 株TP0136 ORF 氨基酸序列分析結(jié)果：BioEdit 7.1 軟件比對顯示，23 株TPA TP0136 ORF 氨 基 酸 序 列 可 分 為4 型，GD008 的TP0136 ORF 序列不同于Ⅰ～Ⅹ型，與Ⅶ型有1個氨基酸序列不同（G370D），記為Ⅺ型，見表2。

3.TP0136 分型與傳統(tǒng)TP 分型部分結(jié)果比較：根據(jù)Arp/Tpr/TP0548 三基因分型法可將23 株TPA分為5型，菌株優(yōu)勢型為14D/f（39.1%，9/23）。若將新的分型方法與傳統(tǒng)分型相結(jié)合，23 株TPA 可分為10 型，其中9 株傳統(tǒng)的14D/f 亞型可進一步分為3型。見表2、圖2。

討 論

圖1 14 株密螺旋體的TP0136 蛋白多重氨基酸序列比對圖 I ～X 表示TP0136 蛋白氨基酸的10種不同序列型別

表2 23株梅毒螺旋體臨床株分型情況

圖2 23株梅毒螺旋體臨床株的Tp0136基因型別分布

隨著基因組數(shù)據(jù)的不斷累積，全基因組DNA指紋圖譜技術(shù)揭示TP各亞種基因組之間具有高度相似性，這使通過分子靶點在分子水平上對TP 不同亞種進行區(qū)分成為可能。在眾多TP 候選靶點中，TP0136 ORF區(qū)在不同TP亞型和菌株之間表現(xiàn)出高度多態(tài)性，成為當(dāng)前研究的熱點。這促使我們對9 株TPA、3 株TPE、1 株FB 和1 株TEN 的TP0136ORF 氨基酸序列進行多重比對分析。我們發(fā)現(xiàn)，TP0136 基因可顯著區(qū)分TP 中除TPE（CDC2株）和FB 以外的4 個種（TPA、TPE、FB、TEN），表明TP0136 異質(zhì)性可用于不同致病性螺旋體的分子分型。

我國TPA 新發(fā)感染率連續(xù)數(shù)年居甲乙類傳染病第三位，且逐年上升，已成為不容忽視的公共衛(wèi)生問題［10］。1998 年，美國疾病控制和預(yù)防中心建立了基于Arp和Tpr序列差異的首個TPA雙基因分型方法［4］，Marra等［3］在此基礎(chǔ)上引入TP0548基因，提出具有更強區(qū)分能力的CDC 亞型/TP0548 三基因聯(lián)合分型法。流行病學(xué)調(diào)查顯示，梅毒在各地區(qū)的優(yōu)勢流行株具有一定的分布特征。近年多項研究表明［11-12］，中國大陸多個地區(qū)流行的梅毒優(yōu)勢亞型14D/f 在TPA 感染者中占比可高達66% ～88.8%。Marra等［3］對西雅圖地區(qū)TPA分型后發(fā)現(xiàn)，14D/f亞型與神經(jīng)梅毒有著緊密聯(lián)系。然而在我國所有14D/f 亞型感染者中，僅4.5%最終確診為神經(jīng)梅毒［11］?，F(xiàn)有TPA 分型方法無法區(qū)分我國近90%梅毒感染者中TPA分子型別，無法準(zhǔn)確用于我國梅毒分子流行病學(xué)研究及臨床評估，因此迫切需要一種更有效的TPA分子分型方法。

本研究中，我們利用建立的TP0136 蛋白分子分型方法，將23株TPA臨床分離株分為4種序列類型。而根據(jù)傳統(tǒng)的三基因分型法可分為5 型，將TP0136 分型方法與傳統(tǒng)分型相結(jié)合后可分為10 型，優(yōu)勢菌株14D/f 亞型可被進一步分為3 型。其中，TP0136 序列Ⅺ型是在廣東地區(qū)TPA 臨床分離株中新發(fā)現(xiàn)的特有型別，僅與Ⅶ型在第370位氨基酸存在差異（G370D）。在23 株TPA 臨床分離株中，69.6%（16/23）為Ⅸ型，即SS14 型。該基因型可能與大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥密切相關(guān)［13］。Stamm等［14］發(fā)現(xiàn)阿奇霉素耐藥表型的SS14 株TPA 23S rRNA基因在第2058位點發(fā)生腺嘌呤（A）→鳥嘌呤（G）突變，且該型菌株在多次傳代后均表現(xiàn)出穩(wěn)定的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥表型。我國指南建議［15］臨床采用阿奇霉素、紅霉素等大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療青霉素過敏的母嬰梅毒患者，而TPA對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥現(xiàn)象將影響TPA治療的有效性，增加先天梅毒兒的出現(xiàn)。因此，通過將TP0136 分型方法與傳統(tǒng)分型相結(jié)合，不僅可用于進一步細(xì)化TPA分型，或許還具有指導(dǎo)臨床用藥的作用。

綜上，TP0136 蛋白異質(zhì)性可用于鑒別TP 的TPA、TPE、FB 和TEN 亞種，TP0136 分子分型將有助于進一步完善TPA分型方法，為探究基因型別與臨床診斷、發(fā)展轉(zhuǎn)歸及耐藥監(jiān)測提供幫助。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突