嬰兒血管瘤長鏈非編碼RNA與mRNA表達(dá)譜分析

楊開穎 代詩懿 邱桐 周江元 陳思源 吉毅

1四川大學(xué)華西醫(yī)院小兒外科，成都610041；2四川大學(xué)華西醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，成都610041

嬰兒血管瘤（infantile hemangioma，IH）是嬰幼兒最常見的良性腫瘤，發(fā)病率為4%～5%［1］。絕大多數(shù)IH 可自然消退，但仍有10%～15%的IH 可引起嚴(yán)重并發(fā)癥［2］。研究表明，血管發(fā)生與血管生成均參與IH的發(fā)病過程，但確切機(jī)制尚不清楚［3］。目前，長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）已被證實(shí)在內(nèi)皮細(xì)胞分化及血管生成等方面發(fā)揮重要調(diào)控作用［4］。本研究旨在通過基因芯片技術(shù)分析增殖期與消退期IH的lncRNA差異表達(dá)情況，并利用生物信息學(xué)技術(shù)分析lncRNA 參與調(diào)控IH發(fā)病的機(jī)制。

對象與方法

一、對象

2019年1-3月在四川大學(xué)華西醫(yī)院小兒外科行手術(shù)切除治療（在向所有患兒家屬介紹如口服普萘洛爾等非手術(shù)治療的前提下，家屬綜合考慮后首先選擇手術(shù)切除治療）的8 例IH 組織（表1），所有患兒在術(shù)前均未采取過任何治療措施。術(shù)中將切下標(biāo)本組織分成兩份，一份立即轉(zhuǎn)運(yùn)至-80 ℃冰箱長期儲存；另一份用于病理診斷及分期。經(jīng)HE 染色（圖1）和免疫組化葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GLUT-1）染色（圖2）分析，結(jié)合臨床特征，依據(jù)文獻(xiàn)［5］確診增殖期與消退期各4 例。其中，增殖期IH 顏色鮮艷，瘤體會逐漸生長并凸出體表，表面張力大；消退期IH顏色暗紅，瘤體逐漸縮小變軟，中心可以緩慢退化變白。本研究獲得四川大學(xué)華西醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批件號：2017414），取材前所有患兒家屬簽署知情同意書。

二、方法

1.RNA提取和lncRNA與mRNA表達(dá)譜芯片制備：采用Trizol試劑（美國Thermo Fisher Scientific公司）提取組織中總RNA，采用miRNeasy Minikit試劑盒（美國Qiagen 公司）將RNA 提純，使用Nano Drop 2000（美國Thermo Fisher Scientific 公司）分光光度計(jì)對RNA 進(jìn)行定量，同時(shí)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)檢，最終將制備的RNA樣本儲存于-80 ℃液氮中備用。采用Affymetrix GeneChip Human Transcriptome Array 2.0二代高通量芯片（美國賽默飛世爾科技公司）分析增殖期與消退期IH lncRNA與mRNA的差異表達(dá)譜，包含245 000余條mRNA探針和40 000余條lncRNA探針。每個(gè)標(biāo)本都進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的芯片上樣處理。基因芯片探針設(shè)計(jì)由上海其明科技有限公司完成。

表1 8例嬰幼兒局灶性混合型血管瘤臨床相關(guān)資料

圖1 嬰兒血管瘤皮損病理表現(xiàn)（HE×400） 1A：增殖期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞高度增殖，血管管腔密集，罕見脂肪組織；1B：消退期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞逐漸成熟，血管團(tuán)塊逐漸形成管腔結(jié)構(gòu)，血管管腔粗大肥厚，脂肪組織浸潤增多 圖2 免疫組化檢查（葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1 染色×400） 2A：增殖期血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞染色陽性且豐富表達(dá)；2B：消退期血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1，但表達(dá)強(qiáng)度減少

2.生物信息學(xué)分析：①通過基因芯片篩選得到差異表達(dá)的lncRNA 與mRNA（篩選標(biāo)準(zhǔn)：P ＜0.05，差異倍數(shù)＞1.5）；②對差異表達(dá)mRNA 進(jìn)行GO 功能和KEGG 通路富集分析；③構(gòu)建lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，以相關(guān)系數(shù)＞0.97 或＜-0.97 及P ＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行l(wèi)ncRNA 靶基因篩選，并用Cytoscape 軟件對其進(jìn)行可視化處理；④對lncRNA靶基因進(jìn)行GO和KEGG分析，以預(yù)測lncRNA功能作用。以上分析在上海其明公司GCBI（https：//www.gcbi.com.cn/）平臺完成。

3. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）驗(yàn)證：采用SYBR Green qPCR方法，驗(yàn)證增殖期與消退期IH組織中部分差異lncRNA 與mRNA 的表達(dá)，重復(fù)3次。采用TRIzol 試劑提取組織中總RNA 后進(jìn)行核酸定量，參照cDNA 合成試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，選用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參基因，引物序列詳見表2。qPCR（美國賽默飛世爾科技公司）實(shí)驗(yàn)反應(yīng)條件為：95 ℃30 s；95 ℃15 s，60 ℃30 s共40個(gè)循環(huán)，最后做熔解解曲線分析。每份樣品重復(fù)檢測3次，采用2-△△Ct法計(jì)算差異lncRNA 與mRNA的相對表達(dá)量。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，連續(xù)性變量用±s 表示，采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)比較組間差異（P ＜0.05，差異倍數(shù)≥1.5）。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、增殖期和消退期IH差異表達(dá)的lncRNA與mRNA

以消退期IH 組織為參照組，增殖期IH 中共篩選出405條差異lncRNA，其中108條下調(diào)，297條上調(diào)，同時(shí)篩選出772 條差異mRNA，其中107 條下調(diào)，665 條上調(diào)（圖3）。前20 條差異lncRNA 與前30條差異mRNA分別見表3和表4。

二、增殖期和消退期IH差異mRNA的GO功能與KEGG通路富集分析

GO 功能分析顯示，差異mRNA 主要參與血管凝固、軸突導(dǎo)向、血管生成和細(xì)胞黏附以及對缺氧反應(yīng)、凋亡過程、細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)控等生物過程；KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)，差異mRNA 主要富集在代謝通路、細(xì)胞局部黏附、肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶（PI3K-Akt）、血管平滑肌收縮等信號通路（圖4）。

三、增殖期和消退期IH lncRNA-mRNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

經(jīng)Cytoscape 可視化處理后生成的lncRNAmRNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)由370 個(gè)節(jié)點(diǎn)及1 244 條關(guān)系組成。為更好地展示lncRNA-mRNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，選取度值（degree，一個(gè)點(diǎn)的度指圖中該點(diǎn)所關(guān)聯(lián)的邊數(shù)）≥15的差異lncRNA和mRNA構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)由81個(gè)節(jié)點(diǎn)（23條mRNA和58條lncRNA）及269條關(guān)系組成。從此網(wǎng)絡(luò)中可知，1條lncRNA 可同時(shí)與多條mRNA 發(fā)生相互作用關(guān)系（圖5）。

四、增殖期和消退期IH lncRNA靶基因預(yù)測

結(jié)合lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，對lncRNA進(jìn)行靶基因順式作用（cis）預(yù)測。通過尋找lncRNA上下游10 kb 范圍之內(nèi)的mRNA，以相關(guān)系數(shù)＞0.97或＜-0.97 及P ＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)共篩選出18 對lncRNA-mRNA（表5）。對這些lncRNA預(yù)測的靶基因進(jìn)行GO 功能及KEGG 通路分析，發(fā)現(xiàn)這些基因主要富集在“正向調(diào)控神經(jīng)元分化”、“正向調(diào)控細(xì)胞分化”及“細(xì)胞膜電位調(diào)控”等生物過程以及“胰腺分泌信號通路”與“環(huán)腺苷酸信號通路”等。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

圖3 增殖期和消退期嬰兒血管瘤差異表達(dá)的lncRNA（3A）與mRNA（3B）聚類圖 P：增殖期；I：消退期。在增殖期血管瘤中表達(dá)上調(diào)的lncRNA或mRNA均要比消退期多

表3 增殖期和消退期嬰兒血管瘤前20條差異（P ＜0.001）表達(dá)的lncRNA

表4 增殖期和消退期嬰兒血管瘤前30條差異（P ＜0.001）表達(dá)的mRNA

圖4 增殖期和消退期嬰兒血管瘤前20條差異表達(dá)的mRNA GO功能（4A）及KEGG通路（4B）富集結(jié)果

圖5 度值（degree）≥15 的lncRNA-mRNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖●代表mRNA，代表lncRNA；紅色代表上調(diào)，黃色代表下調(diào)。1條lncRNA可同時(shí)與多條mRNA發(fā)生相互作用關(guān)系

表5 增殖期和消退期嬰兒血管瘤差異表達(dá)的lncRNA靶基因預(yù)測

五、qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果

隨機(jī)選擇差異表達(dá)的4 條lncRNA（n335248、ENST00000450864、n333319 和n335185）與4 條mRNA（EDNRA、IFI6、HK2 與ITGA1）進(jìn)行qPCR 驗(yàn)證，結(jié)果與芯片檢測結(jié)果一致。見圖6、表6。

討 論

圖6 qRT-PCR 結(jié)果驗(yàn)證增殖期和消退期嬰兒血管瘤差異表達(dá)的lncRNA 與mRNA 1：IFI6；2：HK2；3：ITGA1；4：EDNRA；5：n335248； 6：n333319； 7：n335185； 8：ENST00000450864。Microarray：基因芯片；qRT-PCR：實(shí)時(shí)熒光定量PCR

表6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測增殖期和消退期嬰兒血管瘤差異表達(dá)的lncRNA與mRNA（±s）

表6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測增殖期和消退期嬰兒血管瘤差異表達(dá)的lncRNA與mRNA（±s）

注：n=3

mRNA/lncRNA IFI6 HK2 ITGA1 EDNRA n335248 n333319 n335185 ENST00000450864增殖期1.25±0.20 0.93±0.14 0.47±0.38 1.20±0.19 0.54±0.46 0.50±0.36 1.16±0.21 1.33±0.30消退期0.68±0.33 1.51±0.83 0.29±0.04 0.66±0.17 0.18±0.09 0.25±0.21 0.98±0.46 2.32±0.99 t值3.13-1.39 0.80 4.12 1.70 1.11 0.58-2.37 P值0.020 0.254 0.455 0.006 0.126 0.304 0.583 0.398

IH 是嬰幼兒時(shí)期最常見的良性腫瘤，具有典型的生長特征，即先快速增殖后緩慢消退［2］。研究表明，多條通路及多種基因參與IH 的發(fā)病過程［6］，但是IH 從增殖期向消退期演化的機(jī)制仍然不明。隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展，基因芯片越來越廣泛地用于輔助臨床疾病的診斷與治療。lncRNA 是長度＞200 個(gè)核苷酸的分子，不具有編碼蛋白質(zhì)功能。研究表明lncRNA 可以參與多種生物學(xué)功能，如在轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控mRNA 表達(dá)，從而影響細(xì)胞增殖、分化、凋亡和遷移，發(fā)揮調(diào)控血管生成的作用［7-8］。然而，lncRNA在IH中的表達(dá)情況及其所發(fā)揮的功能目前仍不清楚。為了更好地研究IH 中l(wèi)ncRNA 的作用，我們通過對比增殖期與消退期IH組織中l(wèi)ncRNA 與mRNA 的差異表達(dá)情況，結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)，篩選出與IH 發(fā)生發(fā)展相關(guān)的lncRNA 與mRNA，同時(shí)構(gòu)建lncRNA-mRNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。該共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)表明，lncRNA 與mRNA 之間的聯(lián)系并不是簡單的一一對應(yīng)關(guān)系。1 條mRNA可以由多條lncRNA共同調(diào)節(jié)，同樣地，1條lncRNA也可以作用于多條mRNA。這進(jìn)一步佐證了IH 發(fā)病機(jī)制及發(fā)生發(fā)展過程的復(fù)雜化。通過lncRNAmRNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，我們對lncRNA 靶基因進(jìn)行預(yù)測，如lncRNA n405879靶基因RAB11A可以通過調(diào)控表皮生長因子的表達(dá)影響細(xì)胞分化［9］，這為進(jìn)一步深入探討血管瘤的發(fā)病機(jī)制提供了新方向。

本研究中，共篩選出445 條差異lncRNA 與772 條差異mRNA，這些差異基因不僅包括已經(jīng)被證實(shí)參與調(diào)控IH 發(fā)病機(jī)制的重要基因，如DLL4、HIF1A、JAG1、HEY1 及PDGFRB 等［10-11］，可參與Notch 信號通路，調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移［6］，還包括許多尚未發(fā)現(xiàn)與IH 相關(guān)的基因，如與血管生成相關(guān)的基因LEPREL1、RAMP2 及SERPINE1 等［12-14］，它們可能在IH 發(fā)生發(fā)展過程中調(diào)控血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化等，從而調(diào)控IH血管生成。GO 功能富集顯示，差異基因除了富集在血管生成、細(xì)胞黏附、對缺氧刺激反應(yīng)等所熟知的參與IH發(fā)病機(jī)制的功能外［3］，還富集在一些尚未在IH 領(lǐng)域內(nèi)被深入研究的新的生物功能，如血液凝固與血小板激活及肌動蛋白細(xì)胞骨架等。既往研究顯示，消退期IH 比增殖期IH 中Ⅲ型膠原蛋白和層黏連蛋白大量沉積［15］，普萘洛爾可以通過降低細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（基質(zhì)金屬蛋白酶9）的表達(dá)，從而抑制血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞血管生成［16］，這些功能均有報(bào)道與腫瘤生長存在聯(lián)系［17-18］。

同樣，本研究中KEGG 通路分析顯示，差異基因除富集在局部黏附通路、PI3K-Akt信號通路及細(xì)胞黏附分子通路等已知的與IH發(fā)生發(fā)展相關(guān)的通路外，還富集在代謝通路、肌動蛋白骨架調(diào)控通路、血管平滑肌收縮通路及胰島素信號通路等尚未在IH發(fā)病機(jī)制中被深入研究的通路。如參與代謝通路的HK2基因，其作為糖酵解通路的關(guān)鍵酶之一，可以通過促進(jìn)乳酸產(chǎn)生從而調(diào)控腫瘤生長與遷移［19］，同時(shí)研究顯示，PI3K-Akt 信號通路可以通過調(diào)控HK2的表達(dá)發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)腫瘤生長的作用［20］，這表明HK2 所參與的糖代謝通路很有可能也在IH發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。以上結(jié)果表明，多種差異基因可能參與多個(gè)生物過程以及多條信號通路，共同發(fā)揮對IH 發(fā)生發(fā)展過程的調(diào)控。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突