不同測試指標(biāo)及觀測時段對情景條件恐懼實(shí)驗(yàn)檢測5XFAD 轉(zhuǎn)基因小鼠行為學(xué)效力的影響

張 童，張瑩林，姚俊巖

上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院麻醉科，上海200080

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種進(jìn)展性的神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)、記憶及運(yùn)動能力隨年齡增長不斷惡化。AD 患者腦內(nèi)β 淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）的大量聚集所產(chǎn)生的神經(jīng)毒性是其產(chǎn)生認(rèn)知和運(yùn)動功能障礙的主要原因。近年來，圍繞Aβ 的研究一直是AD 領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。

在AD 相關(guān)的動物實(shí)驗(yàn)中，行為學(xué)研究往往是后續(xù)機(jī)制研究的重要前提。目前行為學(xué)研究采用較多的是曠場（open field，OF）實(shí)驗(yàn)和條件恐懼（fear conditioning，F(xiàn)C）實(shí)驗(yàn)。OF 實(shí)驗(yàn)主要用于評價AD 小鼠的運(yùn)動狀態(tài)，即將實(shí)驗(yàn)小鼠放置在四周封閉的空曠場域內(nèi)任其進(jìn)行自由活動，在此過程中觀察小鼠探索曠場的周邊區(qū)域產(chǎn)生的一系列自發(fā)活動，記錄其運(yùn)動路程和運(yùn)動速度，即可得出實(shí)驗(yàn)小鼠自發(fā)活動性[1-2]。情景條件恐懼（contextual fear conditioning，CFC）實(shí)驗(yàn)則用于測試AD 小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力。該實(shí)驗(yàn)分為訓(xùn)練和測試2 個階段，主要原理為在訓(xùn)練階段通過恐懼刺激使實(shí)驗(yàn)小鼠形成相關(guān)記憶，繼而在測試階段根據(jù)實(shí)驗(yàn)小鼠對環(huán)境刺激做出的恐懼反應(yīng)，判斷其學(xué)習(xí)和記憶能力是否受損。

據(jù)報道[3-5]，5XFAD 小鼠在1.5 月齡時，腦內(nèi)已經(jīng)有大量的Aβ 聚集；在2 月齡時，即出現(xiàn)淀粉樣斑塊的沉積；4 ～5 月齡時已可檢測到其學(xué)習(xí)與記憶功能障礙，是研究AD 發(fā)生和發(fā)展機(jī)制的重要工具小鼠。然而，國內(nèi)外學(xué)者采用CFC 實(shí)驗(yàn)檢測5XFAD 小鼠學(xué)習(xí)和記憶功能障礙時，采用的評價指標(biāo)和觀測時段各不相同。在CFC 實(shí)驗(yàn)中，評價小鼠對恐懼反應(yīng)記憶能力最常用的2 個指標(biāo)分別為僵直時間百分比（percent freeze，PF）和活動抑制率（activity suppression ratio，ASR）。PF 是指在特定的觀測時段內(nèi)小鼠處于僵直姿勢的時間占比。雖然PF 是經(jīng)典指標(biāo)，但有學(xué)者提出僅采用PF 反映實(shí)驗(yàn)小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力，無法避免自發(fā)活動性不同對檢測結(jié)果造成的偏倚，采用ASR 似乎更為精確[6-7]。上述評價指標(biāo)和觀測時段設(shè)定的不同，則將導(dǎo)致CFC 實(shí)驗(yàn)的檢測結(jié)果出現(xiàn)明顯差異。如何提高CFC實(shí)驗(yàn)對已經(jīng)存在一定程度認(rèn)知障礙的5XFAD 小鼠學(xué)習(xí)和記憶受損的檢出效力，值得進(jìn)一步探討。

本研究采用已出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙的4 月齡5XFAD 轉(zhuǎn)基因小鼠及其Littermates 小鼠（與5XFAD 小鼠同窩出生但基因型鑒定為陰性的小鼠，即LM 小鼠）為實(shí)驗(yàn)對象，首先采用OF 實(shí)驗(yàn)測定2 種小鼠自發(fā)活動性，繼而采用CFC 實(shí)驗(yàn)評估小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。通過分析2 種小鼠在OF 實(shí)驗(yàn)中的總路程和速度以及在CFC 實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練階段前60 s 的平均運(yùn)動指數(shù)（average motion index，AMI），比較2 種小鼠自發(fā)活動性的差異，以及PF 和ASR 對2 種小鼠學(xué)習(xí)記憶能力差異性的檢出效力。在CFC 測試階段，分別選取測試階段前180 s、181 ～360 s 或前300 s 觀測實(shí)驗(yàn)小鼠的運(yùn)動狀態(tài)，比較測試階段時間段的選擇對2 種小鼠PF 和ASR 的影響。

1 對象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

將4 只2 月齡、體質(zhì)量20 ～24 g 的雄性SPF 級5XFAD小鼠 [購自蘇州昭衍新藥研究中心有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（蘇）2018-0006]與16 只3 月齡、體質(zhì)量18 ～23 g 的雌性SPF 級C57BL/6J 野生型小鼠[購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2018-0006]置于復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF 級環(huán)境中飼養(yǎng)繁育，并按雌雄比4:1 進(jìn)行合籠擴(kuò)群（每籠5 只）。飼養(yǎng)過程嚴(yán)格按照SPF 級動物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，實(shí)行自由采食和飲水，每周更換3 次墊料并補(bǔ)充飼料和飲用水。飼養(yǎng)環(huán)境內(nèi)的溫度控制在22 ～28 ℃，濕度控制在40%～60%，通風(fēng)良好，環(huán)境安靜，室內(nèi)每日晝夜明暗交替時間為12 h/12 h。所有動物相關(guān)操作均遵循國家及上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一人民醫(yī)院有關(guān)動物倫理規(guī)定及條例。

1.2 轉(zhuǎn)基因小鼠基因型鑒定

1.2.1 主要試劑 組織裂解試劑盒（KG205）購自天根生化科技有限公司，2×Taq PCR 預(yù)混試劑Ⅱ（KT211）購自天根生化科技有限公司，100 bp DNA 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（MD109-01）購自天根生化科技有限公司，瓊脂糖（A9539）購自美國Sigma 公司，GeneRed 核酸染料（RT211）購自天根生化科技有限公司，50×TAE Buffer（RT204）購自天根生化科技有限公司。

1.2.2 主要儀器 PCR 擴(kuò)增儀（ProFlex）購自美國ABI公司，低溫離心機(jī)（Microfuge20R）購自美國Beckman 公司，渦旋儀（S1010E）購自美國Scilogex 公司，凝膠電泳系統(tǒng)（170-4406）美國購自Bio-Rad 公司。

1.2.3 PCR 引物 所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成（表1）。

表1 基因鑒定引物序列 Tab 1 DNA identification primer sequences

1.2.4 基因鑒定方法 5XFAD 雄鼠與C57BL/6J 野生型雌鼠繁殖的子代小鼠生長達(dá)3 ～4 周齡時，剪取其尾組織0.5 ～1 cm 放入1.5 mL 的無菌EP 管中，使用乙醇棉球按壓鼠尾止血。取材期間冰浴放置存放鼠尾的EP 管。每個EP 管中加入組織裂解液48 μL 后離心震蕩，于65 ℃消化30 min，其間每隔10 min 彈撥管底使組織和裂解液充分混勻。后于100 ℃煮沸5 min 以滅活消化酶。置于4 ℃降溫后，于4 ℃ 9 168×g 離心20 min。取上清液即為DNA 模 板。PCR 反 應(yīng) 體 系（20 μL）：2×Taq PCR Master Mix 10 μL、模板DNA 1 μL、引物2.4 μL 和RNase-free 水6.6 μL。體系配置完畢后，使用PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)35 次；72 ℃，5 min 后終止反應(yīng)。進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)的同時，制備1.6%瓊脂糖凝膠，凝膠溶液凝固前按1:20 000 加入GeneRed 核酸染料。將擴(kuò)增產(chǎn)物加入瓊脂糖凝膠孔道中電泳，電泳參數(shù)設(shè)置為電壓110 V，持續(xù)30 min。電泳過程中使用100 bp DNA 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)注DNA 相對分子質(zhì)量梯度。電泳結(jié)束后將凝膠置于凝膠成像儀中進(jìn)行成像分析。當(dāng)PCR 引物擴(kuò)增產(chǎn)物長度同時存在377 bp 和608 bp 時，表明該動物同時表達(dá)APP 和PS1 基因，判定為5XFAD 轉(zhuǎn)基因小鼠；而其擴(kuò)增產(chǎn)物長度僅為324 bp 時，表明該動物不表達(dá)上述2 種基因，判定為同窩同齡LM 小鼠。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

將小鼠按基因表型分類，于SPF 級環(huán)境內(nèi)飼養(yǎng)至4 月齡。選取雌性5XFAD 轉(zhuǎn)基因小鼠12 只為AD 組，雌性同窩同齡LM 小鼠14 只為對照組，進(jìn)行后續(xù)研究。先將實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行OF 實(shí)驗(yàn)，結(jié)束后使其休息1 d，再進(jìn)行 CFC實(shí)驗(yàn)的訓(xùn)練和測試。

1.4 OF 實(shí)驗(yàn)

1.4.1 OF 實(shí)驗(yàn)動物行為學(xué)分析系統(tǒng) 采用 Noldus 曠場實(shí)驗(yàn)分析系統(tǒng)進(jìn)行行為學(xué)測試。該系統(tǒng)包括敞箱、視頻記錄系統(tǒng)和視頻分析系統(tǒng)3 個部分。敞箱為尺寸40 cm×40 cm×60 cm 的封閉箱子，頂部中央安置攝像機(jī)，實(shí)時拍攝實(shí)驗(yàn)小鼠的活動狀態(tài)，并連接記錄系統(tǒng)。

1.4.2 OF 實(shí)驗(yàn)過程 將實(shí)驗(yàn)小鼠置于敞箱內(nèi)，任其自由探索300 s，放回原飼養(yǎng)籠。小鼠探索期間記錄其在曠場中的運(yùn)動總路程、中央?yún)^(qū)域運(yùn)動路程、周邊區(qū)域運(yùn)動路程，以評估小鼠的自發(fā)活動性。相鄰2 只小鼠實(shí)驗(yàn)間隔期間，使用75%乙醇擦洗敞箱內(nèi)部，清理該小鼠的排泄物和氣味，以減少對自發(fā)活動性的影響。

1.5 CFC 行為學(xué)訓(xùn)練及測試

1.5.1 CFC 訓(xùn)練 采用CFC 實(shí)驗(yàn)裝置（Med Associates）進(jìn)行行為學(xué)測試。該系統(tǒng)由測試箱、電擊刺激控制系統(tǒng)、聲音刺激控制系統(tǒng)、紅外視頻跟蹤和記錄系統(tǒng)以及動物行為分析系統(tǒng)5 個部分組成。紅外視頻跟蹤和記錄系統(tǒng)可拍攝并記錄測試箱內(nèi)的畫面，記錄頻率為30 f/s，每幀畫面為320×240 像素。動物行為分析軟件（Video Freeze）可綜合“空白”畫面（未放置小鼠的測試箱畫面）以及相鄰2 幀畫面，計算出相鄰2 幀畫面中改變的像素數(shù)目，該數(shù)目即小鼠的運(yùn)動指數(shù)（Δpixels/f）。在選定觀測時段后，動物行為分析軟件即可完成上述計算并得出該時段內(nèi)小鼠的平均運(yùn)動指數(shù)（average motion index，AMI）。AMI 可反映小鼠在選定觀測時段內(nèi)的運(yùn)動情況。本實(shí)驗(yàn)中，將小鼠置于情景條件恐懼箱中熟悉環(huán)境180 s 后，給予小鼠60 s 聲音刺激（3.6 kHz，80 dB），在聲音刺激結(jié)束前0.5 s，給予0.5 s 不可逃避的足底電擊（0.8 mA），間隔120 s 后，重復(fù)上述刺激過程一次，使小鼠產(chǎn)生情景條件恐懼。條件刺激結(jié)束后使小鼠在箱中停留90 s，隨后放回日常飼養(yǎng)籠。將動物行為分析軟件（Video Freeze）的參數(shù)運(yùn)動閾值設(shè)置為18 pixels/f，最小僵直狀態(tài)持續(xù)時間設(shè)置為30 f，選定訓(xùn)練階段的前60 s 作為觀測時段，即可得到2 組小鼠在該時段內(nèi)的AMI 值，據(jù)此比較2 組小鼠自發(fā)活動性的差異。

1.5.2 CFC 記憶測試 在CFC 訓(xùn)練結(jié)束后的第6日，對2 組實(shí)驗(yàn)小鼠分別進(jìn)行測試，評估小鼠對于情景恐懼的記憶能力。將小鼠置于訓(xùn)練階段的測試箱箱體內(nèi)390 s，其間不給予聲音和電擊刺激，其他測試箱內(nèi)條件與訓(xùn)練階段相同。將動物行為分析軟件（Video Freeze）的參數(shù)運(yùn)動閾值設(shè)置為18 pixels/f，最小僵直狀態(tài)持續(xù)時間設(shè)置為30 f，選定測試階段的前180 s、181 ～360 s 或前300 s 作為觀測時段，即可得到小鼠在該時段內(nèi)的PF 和AMI。測試階段不同觀測時段內(nèi)的ASR 由以下公式計算：ASR=測試階段選定時段的AMI/（測試階段選定時段的AMI+訓(xùn)練階段前60 s 的AMI）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism7.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。PF 實(shí)測值和ASR 以±s 表示。采用單因素方差分析比較3 個不同觀測時段的PF 實(shí)測值和ASR。采用獨(dú)立t 檢驗(yàn)比較2 組小鼠的PF 和ASR。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)群繁育

3 月齡雌性C57BL/6J 野生型小鼠與2 月齡雄性5XFAD 小鼠交配后，成功繁殖出子代幼鼠。每只母鼠孕期為19 ～21 d，哺乳期為18 ～23 d。每胎平均產(chǎn)4 ～6 只幼鼠，成活率＞95%。新生小鼠達(dá)4 月齡，基因表型鑒定后，隨機(jī)抽取26 只雌性子代小鼠以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 小鼠基因表型鑒定結(jié)果

選取親代C57BL/6J 野生型小鼠作為陰性對照，親代5XFAD 轉(zhuǎn)基因小鼠作為陽性對照。部分實(shí)驗(yàn)小鼠基因表型鑒定結(jié)果如圖1 所示，其中攜帶APP 和PS1 基因者為5XFAD 轉(zhuǎn)基因小鼠（即泳道2、4 ～14、16 ～18 和20），2 種基因均不攜帶者為LM 小鼠（即泳道1、3、15和19）。

圖1 PCR 基因鑒定部分結(jié)果示意圖Fig 1 Schematic diagram of partial results of PCR geno-typing

2.3 5XFAD 小鼠和LM 小鼠自發(fā)活動性的差異

OF 實(shí)驗(yàn)中，5XFAD 小鼠和LM 小鼠的總路程分別為（2 077.0±584.7）cm 和（1 997.0±580.3）cm， 速度分別為（8.446±1.733）cm/s 和（8.149±1.599）cm/s，2 組 差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.785，P=0.725）。CFC 實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練階段的前60 s 中，2 組小鼠的AMI 分別為78.43±30.04和127.50±66.54，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.027）（圖2）。

圖2 CFC 實(shí)驗(yàn)檢測2 組小鼠的自發(fā)活動性Fig 2 Locomotor activity of the two groups by CFC test

2.4 不同觀測時段2 組小鼠PF 和ASR 的比較

評估3 個觀測時段內(nèi)LM 小鼠和5XFAD 小鼠的PF 和ASR，結(jié)果顯示（圖3）：LM 組小鼠在3 個觀測時段下的PF 間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），其ASR 間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；5XFAD 小鼠在3 個觀測時段下的PF 和ASR比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。3 個觀測時段下，2 組小鼠的PF 間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；僅在觀測時段設(shè)定為前180 s時，2 組小鼠的ASR 間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.038）。

圖3 每組小鼠不同觀測時段下PF 和ASRFig 3 PF and ASR among different observation periods in each group of mice

3 討論

本研究采用的5XFAD 轉(zhuǎn)基因小鼠是由Oakley 等[5]通過在AD 模型小鼠APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠中引入5 個家族性AD 的突變位點(diǎn)繁育而成。5 個家族性AD 的突變位點(diǎn)包 括APP695 基 因 的K670N/M671L、1716V 和V717I 位點(diǎn)，以及PS1 基因的M146L、L286V 位點(diǎn)。與其他種類AD 小鼠相比，5XFAD 轉(zhuǎn)基因小鼠的斑塊沉積更加迅速，并可在腦內(nèi)產(chǎn)生極高水平的β 淀粉樣蛋白42（β-amyloid，Aβ42）。5XFAD 轉(zhuǎn)基因小鼠在1.5 月齡時，腦內(nèi)即出現(xiàn)大量的Aβ42；生長到2 月齡時，出現(xiàn)淀粉樣斑塊沉積、膠質(zhì)增多、突觸損傷和神經(jīng)元丟失，隨后出現(xiàn)學(xué)習(xí)、記憶及運(yùn)動能力的損害。因此，5XFAD 轉(zhuǎn)基因小鼠在早期即可模擬AD 患者晚期的神經(jīng)病理過程及行為學(xué)表現(xiàn)，常用于AD發(fā)病機(jī)制和治療效果的實(shí)驗(yàn)研究。本研究成功繁育并且得到表型明確的5XFAD 小鼠和其同窩同齡的野生型對照LM小鼠。

臨床研究[8-10]表明，女性更易患有AD，且女性AD患者的臨床癥狀更為嚴(yán)重。此外，已有動物研究[11]表明，同齡雌性AD 小鼠較雄性更易發(fā)生認(rèn)知功能障礙。因此，本研究選用雌性5XFAD 小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以提高5XFAD 小鼠與LM 小鼠認(rèn)知行為差異的檢出率。

OF 實(shí)驗(yàn)中，小鼠在曠場內(nèi)運(yùn)動的總路程和速度可一定程度反映其自發(fā)活動性[1-2]。臨床研究[12-16]表明，已發(fā)生認(rèn)知功能損害的早期AD 患者較未出現(xiàn)認(rèn)知功能改變的患者更易發(fā)生運(yùn)動功能障礙，運(yùn)動功能異常的早期AD 患者在遠(yuǎn)期也更易發(fā)生認(rèn)知功能障礙。因此，小鼠的自發(fā)活動性可一定程度反映其學(xué)習(xí)和記憶能力。本研究采用4 月齡5XFAD 小鼠和LM 小鼠為研究對象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OF 實(shí)驗(yàn)中2 組小鼠運(yùn)動的總路程和速度無差異，這與O'Leary 等[17]的報道一致。同時該研究還發(fā)現(xiàn)，OF 實(shí)驗(yàn)無法檢測出 6 月齡5XFAD 小鼠的活動性降低。Wagner 等[18]的研究表明，5XFAD 小鼠在7 月齡時，OF 實(shí)驗(yàn)才可檢測出其自發(fā)活動性較LM 鼠小鼠顯著下降；而在4 月齡時，5XFAD 小鼠的認(rèn)知功能已發(fā)生損害，并可能因此發(fā)生自發(fā)活動性降低[5]。因此，OF 實(shí)驗(yàn)中小鼠活動的總路程和速度可能并不能反映其真實(shí)的自發(fā)活動性，是否有更敏感的方法用于檢測出年齡較低的5XFAD 小鼠可能存在的活動性降低一直是研究的難點(diǎn)。本研究在進(jìn)行經(jīng)典OF 實(shí)驗(yàn)后，測定了CFC實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練階段的前60 s 內(nèi)2 組小鼠的AMI。為避免CFC實(shí)驗(yàn)受OF 實(shí)驗(yàn)影響，將其安排于OF 實(shí)驗(yàn)結(jié)束1 d 后進(jìn)行；且在進(jìn)行CFC 實(shí)驗(yàn)前，將小鼠提前1 h 置于實(shí)驗(yàn)環(huán)境中進(jìn)行適應(yīng)。CFC 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5XFAD 小鼠的AMI 值顯著低于LM 小鼠，這說明使用AMI 值較總路程和速度可以更好地反映AD 小鼠的自發(fā)活動性。

CFC 實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)小鼠在受到傷害性刺激后做出的主要防御行為表現(xiàn)為保持僵直姿勢，因此可通過小鼠保持僵直姿勢的時長反映其對情景恐懼的學(xué)習(xí)和記憶能力。該實(shí)驗(yàn)最初應(yīng)用于檢測WT 小鼠的認(rèn)知功能水平，其準(zhǔn)確性和可靠性已得到驗(yàn)證，目前正逐漸應(yīng)用于檢測AD 轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知功能障礙[19]。本研究中，實(shí)驗(yàn)小鼠在訓(xùn)練階段和測試階段均被置于測試箱中，紅外視頻跟蹤和記錄系統(tǒng)記錄小鼠在訓(xùn)練和測試階段中每個時間點(diǎn)的活動狀態(tài)。該方法可方便研究者任意選取2 個階段中的特定時段進(jìn)行觀測和研究。研究者在選取目標(biāo)時段并設(shè)定運(yùn)動閾值和最小僵直狀態(tài)持續(xù)時間后，即可通過動物行為分析軟件評估在觀測時段內(nèi)的每個時間點(diǎn)小鼠是否處于僵直狀態(tài)，繼而得到相應(yīng)的PF。

如上所述，測定PF 首先需要確定觀測時段，因此觀測時段的設(shè)定方法可對行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生重要影響。如測試觀測時段設(shè)定較長，LM 小鼠和5XFAD 小鼠在觀測時段的后期已對環(huán)境產(chǎn)生了新的適應(yīng)，因而降低了檢出兩者情景恐懼記憶差異的敏感度，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性降低；如設(shè)定為測試階段的中間某時段，又可能丟失小鼠初始進(jìn)入環(huán)境時對環(huán)境產(chǎn)生的情景恐懼記憶反應(yīng)，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍會造成偏倚。因此，如何針對特殊的5XFAD 小鼠選擇合適的檢測指標(biāo)和觀測時段值得深入研究。

據(jù)報道，不同學(xué)者選擇的觀測時段存在明顯差異[20-21]。觀測時段設(shè)定的不同，可導(dǎo)致CFC 測試結(jié)果存在明顯差異。因此本研究選取了較為常用的3 個觀測時段，即前180 s、181 ～360 s 和前300 s，分別測定了LM 小鼠和5XFAD 小鼠于3 個觀測時段的PF。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，選取不同觀測時段，LM 小鼠的PF 存在顯著差異。鑒于上述結(jié)果，本研究進(jìn)一步比較了3 種觀測時段下LM 小鼠與5XFAD小鼠的PF 的差異，結(jié)果表明差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。這說明，對于自發(fā)活動性降低的5XFAD 小鼠，PF 無法準(zhǔn)確反映其對于恐懼傷害的真實(shí)記憶，單純選擇PF 將導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)假陰性。鑒于PF 的檢測效力可能受到自發(fā)活動性的影響，本研究測定了2 種小鼠的ASR。ASR 由小鼠在訓(xùn)練階段和測試階段的AMI 值計算獲得，可以去除個體自發(fā)活動性差異的影響，較PF 能夠更準(zhǔn)確地反映恐懼記憶引起的行為改變[6]。本研究首先測定了LM 小鼠和5XFAD 小鼠3 個觀測時段的ASR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 種小鼠分別在3 個觀測時段間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。為進(jìn)一步明確2 種小鼠ASR 間是否存在差異，分別比較了3 個觀測時段下2 組小鼠的ASR；結(jié)果提示在觀測時段設(shè)定為181 ～360 s 或前300 s 時，LM 小鼠和5XFAD 小鼠ASR的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，而當(dāng)觀測時段選取為測試階段的前180 s 時，5XFAD 小鼠的ASR 較LM 小鼠明顯升高。上述結(jié)果說明，雖然觀測時段的選取對單一品系小鼠的ASR 無顯著影響，但在比較不同品系小鼠的ASR 差異時，選取不同的觀測時段可對比較結(jié)果產(chǎn)生影響。在常用的 3 個觀測時段中，測試階段的前180 s 較另外2 個觀測時段可提高2 種小鼠ASR 的差異檢出率。另外，在小鼠自發(fā)活動性存在差異時，ASR 較PF 能夠更準(zhǔn)確地反映行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與相關(guān)研究[6-7]結(jié)論一致。但上述結(jié)果提示，在觀測時段設(shè)定為181 ～360 s 或前300 s 時，5XFAD 小鼠和LM 小鼠的ASR 間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；這可能說明在測試階段的前180 s 內(nèi)，LM 小鼠的情景恐懼記憶較AD組小鼠更強(qiáng)，而在之后的更長的時間段內(nèi)，LM 小鼠逐漸對環(huán)境產(chǎn)生適應(yīng)，導(dǎo)致2 種小鼠的ASR 差異減小。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，4 月齡5XFAD 小鼠的自發(fā)活動性較LM 小鼠已出現(xiàn)明顯降低，采用CFC 訓(xùn)練階段前60 s內(nèi)的AMI 值較經(jīng)典的OF 實(shí)驗(yàn)中的總路程和速度能更靈敏地檢測出5XFAD 小鼠的自發(fā)活動性降低；采用CFC 實(shí)驗(yàn)評估5XFAD 小鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力時，選用ASR 較PF 能夠更真實(shí)地反映5XFAD 小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力受損；選取不同的觀測時段可對不同品系小鼠ASR 的組間比較產(chǎn)生明顯影響，且將觀測時段設(shè)定為測試階段的前180 s 更為合理。

參·考·文·獻(xiàn)

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