李 月 ,孫寒曉,殳 潔,李詠梅,盛慧明#
1. 北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院,吉林132013;2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院檢驗(yàn)科,上海200336
炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease,IBD)是一種慢性炎癥性腸道疾病,包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)和克羅恩?。–rohn's disease,CD)[1]。流行病學(xué)顯示IBD 發(fā)病率在亞洲國(guó)家和其他發(fā)展中國(guó)家呈逐年上升趨勢(shì)[2],嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。目前,其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確[3],臨床上并無(wú)完全治愈IBD 的有效治療手段。因此,進(jìn)一步探討IBD 的發(fā)病機(jī)制,尋找新的防治策略和干預(yù)靶點(diǎn)是目前亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。
胰高血糖素樣肽-1 受體激動(dòng)劑(glucagon-like peptide-1 receptor agonist,GLP-1RA)是目前治療2 型糖尿病的有效藥物,且經(jīng)FDA 批準(zhǔn)使用的GLP-1RA 主要有利拉魯肽、艾塞那肽等[4]。研究[5]表明利拉魯肽不僅具有血糖調(diào)節(jié)作用,還具有抗炎等特性,但關(guān)于利拉魯肽參與腸道炎癥的抗炎作用研究甚少。
隨著對(duì)IBD 的作用機(jī)制的深入研究,人們逐漸聚焦到了一類新的免疫細(xì)胞——固有淋巴細(xì)胞(innate lymphoid cell,ILC)。ILC 是一類與T 淋巴細(xì)胞表型和功能相似的天然免疫細(xì)胞[6]。ILC 家族主要分為3 個(gè)亞群,分別是 1 型ILC(group 1 ILC,ILC1)和自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell,NK) 細(xì) 胞、2 型ILC(group 2 ILC,ILC2)、淋巴組織誘導(dǎo)細(xì)胞和3 型ILC(group 3 ILC,ILC3)[7-8]。ILC 可分泌細(xì)胞因子,主要通過(guò)與間質(zhì)細(xì)胞以及其他免疫細(xì)胞之間的相互作用在IBD 等多種自身免疫性疾病中發(fā)揮效應(yīng)[9]。研究[10-11]顯示ILC 參與腸道黏膜穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié),并在IBD 的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。
葡聚糖硫酸鈉鹽(dextran sulfate sodium,DSS)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型所致臨床和病理特征與人類IBD 相似,因此是研究IBD 常用的動(dòng)物疾病模型[12-13]。本研究通過(guò)對(duì)C57BL/6 小鼠進(jìn)行DSS 誘導(dǎo)構(gòu)建小鼠IBD 模型,應(yīng)用利拉魯肽進(jìn)行治療,從小鼠的糞便性狀、結(jié)腸外觀和病理改變、免疫細(xì)胞數(shù)量以及炎性細(xì)胞因子的表達(dá)等方面評(píng)估利拉魯肽對(duì)DSS 誘導(dǎo)IBD 小鼠的作用,以期為輔助治療IBD 提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6 ~10 周齡C57BL/6 野生型雌性小鼠,體質(zhì)量16 ~22 g,購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(滬)2017-0005。所有小鼠均飼養(yǎng)在中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所SPF 級(jí)動(dòng)物房,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為(滬)SYXK2019-0001。飼養(yǎng)條件如下:動(dòng)物房室內(nèi)溫度18 ~22 ℃,相對(duì)濕度50%~60%,分籠飼養(yǎng),自由攝食飲水,適應(yīng)環(huán)境后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均得到中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。
1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 GalliosTM流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼公司),ECLIPSE 80i 顯微鏡(日本尼康公司),ZHWY-100H經(jīng)典型多振幅軌道搖床(中國(guó)智城分析儀器制造有限公司),Eppendorf AG 22331 Hamburg 低速離心機(jī)(德國(guó)艾本德公司)。
1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 FITC 標(biāo)記的CD3e 抗體、CD11b 抗體、CD11c 抗體、B220 抗體、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GMCSF)抗體,PE 標(biāo)記的白介素-5 (interleukin-5,IL-5)抗體,APC 標(biāo)記的視黃酸相關(guān)的孤兒受體γt (retinoid-related orphan receptor γt,RORγt) 抗 體,PerCP-Cy5.5 標(biāo) 記 的CD11b 抗體、IL-17A 抗體,PE-Cy7 標(biāo)記的IL-13 抗體、CD3e 抗體、CD11b 抗體(美國(guó)eBioscience 公司);PE 標(biāo)記的Siglec-F(sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin F)抗體,APC 標(biāo)記的GATA3(GATA binding protein 3)抗 體、Ly6G(lymphocyte antigen 6 complex locus protein G6D)抗體(美國(guó)BD Biosciences 公司);PE 標(biāo)記的IL-22抗體,PE-Cy7 標(biāo)記的CD11c 抗體,CD16/32 抗體(美國(guó)Biolegend 公司);PE-Cy7 標(biāo)記的B220 抗體(美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公 司 )。PMA(phorbol-12-myristate-13-acetate)(美國(guó)Sigma 公司,貨號(hào)H9268-10G),離子霉素(美國(guó)Sigma 公司,貨號(hào)10004974-1),布雷菲德菌素A(美國(guó)Sigma 公司,貨號(hào)11861-5),LIVE/DEAD?固定式死細(xì)胞染色試劑盒(美國(guó)Invitrogen 公司,貨號(hào)L34955),F(xiàn)oxp3/轉(zhuǎn)錄因子染色緩沖液(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司,貨號(hào)00-5523-00),蘇木精- 伊紅(hematoxylineosin,H-E)染色試劑盒(中國(guó)碧云天公司,貨號(hào)C0105),DSS(美國(guó)MP Biomedicals 公司,貨號(hào)160110),利拉魯肽諾和力注射液(丹麥諾和諾德公司,規(guī)格18 mg/3 mL),二硫蘇糖醇(美國(guó)Promega 公司,貨號(hào)V3155),乙二胺四乙酸(美國(guó)Invitrogen 公司,貨號(hào)25200-072),胎牛血清(美國(guó)GEMINI 公司,貨號(hào)900-108),脫氧核糖核酸酶Ⅰ(美國(guó)Sigma 公司,貨號(hào)DN25-1G),膠原酶Ⅷ(美國(guó)Sigma 公司,貨號(hào)C2139-500M),RPMI 1640 培養(yǎng)基(美國(guó)Invitrogen 公司,貨號(hào)22409015),Percoll 細(xì)胞分離液(德國(guó)Amersham/GE 公司,貨號(hào)17089102)。
1.2.1 動(dòng)物分組及模型構(gòu)建 適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后,隨機(jī)選取20 只小鼠分為4 組,每組5 只,分別為對(duì)照組、利拉魯肽組、模型組和治療組。對(duì)照組小鼠每日飲用無(wú)菌水,并腹腔注射磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS);利拉魯肽組小鼠每日飲用無(wú)菌水,并腹腔注射利拉魯肽;模型組小鼠每日飲用DSS 濃度為3%的無(wú)菌水溶液,并腹腔注射PBS;治療組小鼠每日飲用DSS 濃度為3%的無(wú)菌水溶液,并腹腔注射利拉魯肽。注射液現(xiàn)用現(xiàn)配,PBS 劑量0.6 mg/ (kg·d),利拉魯肽劑量0.6 mg/ (kg·d),共處理7 d。每日觀察并記錄小鼠體質(zhì)量、糞便形態(tài)以及有無(wú)便血等情況,判斷結(jié)腸炎嚴(yán)重程度。
1.2.2 小鼠腸道固有層細(xì)胞的提取 無(wú)菌環(huán)境下取小鼠結(jié)腸,PBS 洗滌后,室溫下在含有1 mmol/L 二硫蘇糖醇的PBS 中振搖10 min,經(jīng)PBS 洗滌,在含有30 mmol/L 乙二胺四乙酸的PBS 中于37 ℃振蕩孵育10 min,重復(fù) 2 次。加入含有1% 胎牛血清、脫氧核糖核酸酶Ⅰ和膠原酶Ⅷ的RPMI 1640 培養(yǎng)液,在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱消化1.5 h 后,劇烈搖動(dòng)組織勻漿,使其通過(guò)100 μm 細(xì)胞過(guò)濾器,室溫以1 048×g 離心20 min 后,從80%和40% Percoll 梯度液的中間層收獲腸道固有層細(xì)胞。
1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)分析 腸道固有層譜系(lineage,Lin)標(biāo)志物包括CD3e、B220、CD11b 和CD11c。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠結(jié)腸內(nèi)的中性粒細(xì)胞(CD11b+Ly6G+)、嗜酸 性 粒 細(xì) 胞(CD11b+Siglec-F+)、ILC2(Lin-GATA3+)和ILC3(Lin-RORγt+),以評(píng)估腸炎的嚴(yán)重程度。將分離出的腸道固有層細(xì)胞,用50 ng/mL PMA 和500 ng/mL 離子霉素刺激4 h,在收獲細(xì)胞前2 h 添加2 μg/mL 布雷菲德菌素A。收集細(xì)胞,使用CD16/32 抗體室溫孵育5 min,然后稀釋CD3e 抗體、B220 抗體、CD11b 抗體、CD11c抗體、Siglec-F 抗體和Ly6G 抗體,4 ℃孵育30 min 進(jìn)行細(xì)胞表面蛋白的染色。經(jīng)PBS 洗滌后,根據(jù)說(shuō)明書(shū)使用Foxp3/轉(zhuǎn)錄因子染色緩沖液將細(xì)胞進(jìn)行固定透化,胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子(GATA3、 RORγt)、細(xì)胞因子(IL-5、 IL-13、IL-17、IL-22 和GM-CSF) 于4 ℃孵 育45 min,PBS 洗滌重懸后經(jīng)GalliosTM流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析,數(shù)據(jù)經(jīng)Flow JoV10 軟件分析。
1.2.4 組織學(xué)分析 取小鼠肛門(mén)以上1 cm 處的結(jié)腸組織,長(zhǎng)約0.5 cm,PBS 洗滌后用4%多聚甲醛固定24 h,將組織包埋在石蠟中,制備5 μm 厚度的組織切片,進(jìn)行H-E 染色。使用光學(xué)顯微鏡隨機(jī)選取3 個(gè)視野,觀察結(jié)腸的病理改變。根據(jù)黏膜層炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度(1 ~3 分)、肌層炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度(0 ~2 分)、杯狀細(xì)胞缺失情況(0 ~2 分)、黏膜糜爛至潰瘍程度(0 ~2 分)等4 個(gè)方面,采用盲法進(jìn)行組織病理學(xué)分析并評(píng)分,最高得分為 9 分[14]。
采用GraphPad Prism 6.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,定量資料用±s 表示,組間比較采用非配對(duì)Student's t 檢驗(yàn)。P<0.05 時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
實(shí)驗(yàn)第5 日,模型組小鼠體質(zhì)量較第1 日下降12.23%,第6 ~7 日體質(zhì)量繼續(xù)下降。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察到小鼠有稀便甚至血便現(xiàn)象,視為建模成功。模型組小鼠腸道內(nèi)血便情況較為嚴(yán)重,而治療組血便情況相對(duì)較輕。實(shí)驗(yàn)第5 日,與對(duì)照組相比,模型組小鼠體質(zhì)量明顯降低(P=0.014);處理7 d 后,與模型組相比,治療組小鼠體質(zhì)量下降明顯緩解(P=0.043)(圖1A)。小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度比較結(jié)果顯示,模型組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度明顯短于對(duì)照組(P=0.008);而治療組與模型組相比,結(jié)腸縮短情況明顯緩解(P=0.007)(圖1B、C)。
圖1 利拉魯肽顯著緩解DSS 誘導(dǎo)的IBD 小鼠結(jié)腸損傷Fig 1 Liraglutide significantly alleviated colon injury induced by DSS in IBD mice
H-E 染色結(jié)果顯示,模型組小鼠黏膜上皮細(xì)胞大量壞死脫落,杯狀細(xì)胞缺失,黏膜下層存在淋巴細(xì)胞重度浸潤(rùn),幾乎沒(méi)有完整的黏膜結(jié)構(gòu)(圖2A)。而經(jīng)過(guò)利拉魯肽處理后,組織學(xué)損傷得到了明顯改善,結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)、固有層腸腺、黏膜肌層相對(duì)完整,黏膜下層輕中度淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。組織病理學(xué)評(píng)分顯示,與對(duì)照組相比,模型組小鼠評(píng)分明顯升高(P=0.008);而經(jīng)過(guò)利拉魯肽處理后,評(píng)分明顯降低(P=0.008)(圖2B)。
圖2 利拉魯肽顯著緩解DSS 誘導(dǎo)的IBD 小鼠結(jié)腸黏膜屏障損傷Fig 2 Liraglutide significantly alleviated the colonic mucosal barrier injury induced by DSS in IBD mice
應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠結(jié)腸內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞比例,以評(píng)估腸炎的嚴(yán)重程度,其分選策略如圖3A所示。結(jié)果(圖3B ~E)顯示模型組小鼠結(jié)腸內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組(均P=0.001),經(jīng)過(guò)利拉魯肽處理后,中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞比例較模型組顯著降低(P=0.004,P=0.002),說(shuō)明利拉魯肽能夠改善DSS 誘導(dǎo)的IBD 小鼠結(jié)腸內(nèi)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。
圖3 利拉魯肽改善DSS 誘導(dǎo)的IBD 小鼠結(jié)腸內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)Fig 3 Liraglutide improved the colonic inflammatory cell infiltration induced by DSS in IBD mice
應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠結(jié)腸ILC2、ILC3 及其分泌的細(xì)胞因子(分選策略如圖4A、B 所示),評(píng)估利拉魯肽處理前后ILC2、ILC3 數(shù)量和功能的變化。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,模型組小鼠結(jié)腸內(nèi)ILC2 占總ILC 的比例升高(P=0.032),而經(jīng)過(guò)利拉魯肽處理后ILC2 比例較模型組降低(P=0.032),提示利拉魯肽可抑制結(jié)腸內(nèi)ILC2 的數(shù)量(圖4C);但通過(guò)比較模型組與治療組之間ILC2 分泌的主要細(xì)胞因子IL-5、IL-13、IL-17 的水平,未發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(結(jié)果未顯示)。與模型組相比,治療組ILC3 的比例明顯增加(P=0.008)(圖4D),其IL-22 的分泌水平亦明顯升高(P=0.008)(圖4E),但2 組間其他細(xì)胞因子IL-17、GM-CSF 分泌水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(結(jié)果未顯示)。
圖4 利拉魯肽影響DSS 誘導(dǎo)的IBD 小鼠腸道ILC 的變化Fig 4 Liraglutide affected the intestinal ILC of IBD mice induced by DSS
本研究通過(guò)分析小鼠的體質(zhì)量變化、結(jié)腸長(zhǎng)度以及結(jié)腸的病理學(xué)改變、免疫細(xì)胞數(shù)量,明確利拉魯肽可延緩DSS 誘導(dǎo)的小鼠IBD 的發(fā)生發(fā)展。對(duì)結(jié)腸內(nèi)ILC 及其分泌的細(xì)胞因子分析后發(fā)現(xiàn),經(jīng)利拉魯肽處理后,DSS 誘導(dǎo)的IBD 小鼠結(jié)腸內(nèi)ILC2 比例明顯降低,ILC3 比例明顯升高,且ILC3 分泌的細(xì)胞因子IL-22 的水平顯著增加。
ILC3 主要存在于腸黏膜組織中,表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子RORγt, 主要分泌IL-22、IL-17 和GM-CSF 等細(xì)胞因子,在黏膜穩(wěn)態(tài)和炎癥反應(yīng)中起重要作用[15]。IL-22 信號(hào)會(huì)誘導(dǎo)黏蛋白產(chǎn)生,還可通過(guò)促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖和存活來(lái)促進(jìn)組織修復(fù)。此外,IL-22 還能促進(jìn)核苷酸寡聚結(jié)構(gòu)域蛋白2(nucleotide oligomerization domain-containing protein 2,NOD2)產(chǎn)生,而NOD2 信號(hào)的激活也可促進(jìn)黏蛋白分泌,保護(hù)腸上皮細(xì)胞免受細(xì)菌侵襲。ILC3 產(chǎn)生的IL-22 可與腸上皮細(xì)胞表達(dá)的受體結(jié)合,通過(guò)激活蛋白酪氨酸激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子(just another kinase-signal transducer and activator of transcription,JAK-STAT)信號(hào)通路,促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖,從而使上皮屏障保持完整性[16]。同時(shí),IL-22 可以誘導(dǎo)產(chǎn)生抗微生物因子Reg( regenerating) - Ⅲβ 和Reg- Ⅲγ,限制共生菌與上皮細(xì)胞接觸,避免腸道炎癥產(chǎn)生[17]。在本研究中,利拉魯肽作用后,腸固有層ILC3 比例及IL-22 的分泌明顯增加,說(shuō)明IL-22 可能通過(guò)以上方式在腸道黏膜免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。
ILC2 主要分布在腸道、肺部、淋巴組織、肝臟和腸系膜中[18],主要分泌Ⅱ型細(xì)胞因子如IL-4、IL-5 和IL-13等。GATA3 是ILC2 的主要轉(zhuǎn)錄因子[19],是ILC2 發(fā)育、存活和功能發(fā)揮的關(guān)鍵調(diào)控因子[20]。在唑酮誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中,ILC2 由于受到IL-25 的刺激,可加速促進(jìn)腸道炎癥[21]。在新確診的IBD 患者中,疾病早期病變處腸黏膜內(nèi)ILC2 比例明顯增加[22],提示ILC2 可能在IBD中發(fā)揮促進(jìn)炎癥的作用。另有研究[23]發(fā)現(xiàn)GLP-1RA 可作用于自身免疫性疾病,如抑制IL-33 的釋放以及過(guò)敏氣道炎癥,推測(cè)GLP-1RA 可能是治療ILC2 介導(dǎo)的過(guò)敏性哮喘的一種新手段。結(jié)合本研究結(jié)果,GLP-1RA 利拉魯肽可能通過(guò)抑制腸道ILC2 從而改善DSS 誘導(dǎo)的小鼠IBD,但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。
近年來(lái)研究[24]發(fā)現(xiàn),ILC 與輔助性T 細(xì)胞類似,具有一定的可塑性。ILC2 在發(fā)育和維持過(guò)程中可能向ILC3 轉(zhuǎn)化,炎性ILC2 可能分化產(chǎn)生IL-17 的ILC3 樣細(xì)胞[25]。在人類CD 患者的腸樣本中發(fā)現(xiàn)ILC2 分泌的IL-13 和γ- 干擾素(interferon-γ,IFN-γ)明顯增加[26],說(shuō)明炎性ILC3 可能轉(zhuǎn)變?yōu)榉置贗FN-γ 的ILC2 樣細(xì)胞。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)中ILC2比例降低伴ILC3 比例升高也提示,存在ILC2 向ILC3 轉(zhuǎn)化的可能性。既往研究表明ILC2 分泌的IL-4 對(duì)于抵抗細(xì)胞外寄生蟲(chóng)感染的保護(hù)性免疫至關(guān)重要[27],同時(shí)也與IBD的嚴(yán)重程度有關(guān)[28]。所以利拉魯肽是否影響ILC2 分泌IL-4,進(jìn)而減緩疾病的進(jìn)程仍需后續(xù)研究進(jìn)一步明確。
此外,本研究仍具有一定的局限性:首先,DSS 誘導(dǎo)的IBD 小鼠模型僅模仿了UC 患者一些典型的組織病理學(xué)特征和某些免疫學(xué)特征,并不能完全代表CD 的復(fù)雜特征;其次,樣本例數(shù)較少。因此,迫切需要開(kāi)發(fā)能夠解決現(xiàn)有局限性且更接近CD 和UC 特征的其他實(shí)驗(yàn)?zāi)P蚚29],并增加研究病例數(shù)以明確實(shí)驗(yàn)結(jié)論。
綜上,本研究發(fā)現(xiàn)GLP-1RA 利拉魯肽可能作用于腸道ILC,明顯延緩DSS 誘導(dǎo)的IBD 小鼠的疾病發(fā)生與發(fā)展,為利拉魯肽的潛在治療用途提供了理論依據(jù)。
參·考·文·獻(xiàn)
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上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)2020年6期