淮山藥RS3抗性淀粉制備及其消化特性

謝三都，陳惠卿，謝小偉，吳秀清

（閩南科技學(xué)院，福建泉州 362332）

淮山藥（Dioscorea opposita），又稱淮山，為多年生藤本植物薯蕷（Dioscorea opposita Thunb.）的塊莖，在我國有2 000多年的種植歷史，是衛(wèi)生部公布的藥食兩用食物[1-3]，是福建省主要栽培的經(jīng)濟(jì)作物之一[4]，富含淀粉。淀粉是由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成的高分子化合物，是大多數(shù)谷物的主要成分[5]。根據(jù)淀粉在人體內(nèi)不同消化速度，淀粉可分為RDS、SDS和RS[6]。根據(jù)不同制備方法RS可分為RS1型（物理包埋法）、RS2型（天然抗性淀粉顆粒）、RS3型（老化淀粉）、RS4型（化學(xué)改性淀粉）。目前，制備淮山藥抗性淀粉的方法主要以壓熱處理、濕熱處理、韌化處理等物理方法為主[7-15]。

以淮山藥為研究對象，采用酶解-壓熱法制備淮山藥RS3抗性淀粉（Chinese Yam Resistant Starch-RS3，簡稱CYRS-RS3），在考查了淮山藥淀粉乳pH值、普魯蘭酶用量、酶解時間、加熱溫度、加熱時間及老化時間對淮山藥RS3抗性淀粉得率影響的基礎(chǔ)上，采用正交試驗優(yōu)化淮山藥RS3抗性淀粉的制備工藝條件，并研究其消化特性，為將淮山藥RS3抗性淀粉作為低熱量、低糖量等食品的良好原料提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

淮山藥，福建省山格農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)有限公司提供，經(jīng)去皮、護(hù)色、切片、烘干、打磨成粉后得淮山藥粉。

1.1.2 試驗試劑

普魯蘭酶（10萬U/g），恒銳食品生物科技有限公司提供；α-淀粉酶（9 U/mg）、糖化酶（10萬U/mL），上海源葉生物科技有限公司提供；C6H12O6、NaOH、 Na2HPO4·12H2O、 CuSO4·5H2O、 KOH、NaKC4H4O6·4H2O，天津市福晨化學(xué)試劑廠提供；KH2PO4，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；HCl，蘭溪旭日化工有限公司提供；K4Fe(CN)6·3H2O、C16H18CIN3S，西隴科學(xué)有限公司提供。以上均為分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備

HH4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司產(chǎn)品；上海雷磁PHS-3CpH計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn)品；FA2004型電子天平，上海衡平儀器儀表廠產(chǎn)品；BCD-168E/C型冰箱，海信科龍電器股份有限公司產(chǎn)品；101-1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；Autoclave·GI36D型高壓滅菌鍋，廈門精藝興業(yè)科技有限公司產(chǎn)品；TDL-60C型低速臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；SHA-B型恒溫振蕩器，國華企業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 抗性淀粉制備流程

參考聶凌鴻等人[16]、阮思蓮等人[17]、李寶瑜等人[18]、對淮山藥RS3抗性淀粉制備方法的研究。準(zhǔn)確稱量2.00 g淮山藥粉，轉(zhuǎn)移至燒杯中，并按1∶9的比例（m/V） 加入蒸餾水配成淀粉乳。待攪拌均勻，用濃度為1 mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5，再加入一定酶底比（普魯蘭酶活力與底物質(zhì)量比，U/g） 的普魯蘭酶液，在60℃恒溫水浴鍋中脫支處理一定時間。調(diào)節(jié)淮山藥粉乳pH值在一定梯度范圍內(nèi)，放入90℃水浴鍋中預(yù)糊化，同時滅酶處理5 min，在設(shè)定一定溫度的高壓滅菌鍋中加熱處理一段時間。取出后室溫冷卻，放于4℃的環(huán)境中，老化回生一段時間，取出樣品涂片干燥、磨粉，過100目篩，即得CYRS-RS3成品。

1.2.2 抗性淀粉含量的測定

參考張麗芳等人[19]、Goni等人[20]抗性淀粉測定方法大致模擬人體內(nèi)環(huán)境條件，先去除易消化淀粉，再用抗性淀粉溶解和酶解，最后測量樣液的葡萄糖含量，以此計算CYRS-RS3得率。

式中：Q——淮山藥抗性粗淀粉中CYRS-RS3得率，%；

X——測得試樣中酶解葡萄糖的含量，g/g；

I——未經(jīng)處理的淮山藥粉還原糖含量，g/g；

m——稱取的抗性淀粉樣品，g；

0.9 ——葡萄糖質(zhì)量與淀粉質(zhì)量轉(zhuǎn)換系數(shù)。

1.2.3 葡萄糖含量的測定

參考王啟軍[21]直接滴定法測定食品中還原糖含量：

式中：X——試樣中酶解葡萄糖的含量，g/g；

A——堿性酒石酸銅溶液（甲、乙各5 mL）相當(dāng)于葡萄糖的質(zhì)量，mg；

m——樣品的質(zhì)量，g；

V1——測定時平均消耗未經(jīng)酶處理樣品溶液的體積，mL；

V2——測定時平均消耗經(jīng)酶處理樣品溶液的體積，mL。

1.2.4 消化率的測定

參考李濤等人[22]、琚長霄[23]根據(jù)In-vitro消化模型模擬人體的內(nèi)環(huán)境，進(jìn)行適當(dāng)修改。在37℃恒溫水浴環(huán)境中模擬人體體溫環(huán)境，用胰α-淀粉酶以及糖化酶同時酶解CYRS-RS3，2種酶之間協(xié)同作用可抑制胰α-淀粉酶產(chǎn)物環(huán)糊精在模型中堆積導(dǎo)致酶活性的降低。再利用透析袋的半透膜特性使酶解的葡萄糖擴(kuò)散于整個模型體中，以模擬人體腸道功能。再用直接滴定法測定燒杯中緩沖液葡萄糖含量，以此計算CYRS-RS3的消化率。

式中：V（平均）——5 h內(nèi)CYRS-RS3平均每1 h樣品消化的量，%；

I——未酶解的淮山藥粉還原糖含量，g/g；

X——在整個模型取出的樣品液中葡萄糖含量，g；

P——模型中取出的樣品液體積，mL；

W——所用CYRS-RS3的質(zhì)量（干基），g；

0.9 ——葡萄糖質(zhì)量與淀粉質(zhì)量轉(zhuǎn)換系數(shù)。

1.2.5 單因素試驗設(shè)計

（1） 普魯蘭酶用量。在淀粉乳中按酶底比為（0，90，180，270，360，450，540 U/g） 加入普魯蘭酶，酶解時間20 min，調(diào)節(jié)pH值6，在100℃壓熱溫度下，加熱處理時間20 min，待冷卻后，4℃環(huán)境下老化時間16 h，測CYRS-RS3得率。

（2）酶解時間。在淀粉乳中按酶底比為180 U/g加入普魯蘭酶，分別酶解（0，5，10，15，20，25，30 min），調(diào)節(jié)pH值6，在100℃壓熱溫度下，加熱處理20 min，待冷卻后，4℃環(huán)境下老化時間16 h，測CYRS-RS3得率。

（3） 淀粉乳pH值。在淀粉乳中按酶底比為180 U/g加入普魯蘭酶，酶解時間5 min，將淀粉乳pH 值調(diào)至 （5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5），在100℃條件下，加熱處理20 min，待冷卻后，4℃環(huán)境下老化處理16 h，測CYRS-RS3得率。

（4）壓熱溫度。在淀粉乳中按酶底比為180 U/g加入普魯蘭酶，酶解時間5 min，調(diào)節(jié)pH值至6，分別在（90，95，100，105，110，115，120℃） 溫度下，加熱處理20 min，待冷卻后，于4℃環(huán)境下老化處理16 h，測CYRS-RS3得率。

（5）壓熱時間。在淀粉乳中按酶底比為180 U/g加入普魯蘭酶，酶解時間5 min，調(diào)節(jié)pH值至6，在100℃溫度下，分別加熱處理（0，10，20，30，40，50，60 min），待冷卻后，4℃環(huán)境下老化處理16 h，測CYRS-RS3得率。

（6）老化時間。在淀粉乳中按酶底比為180 U/g加入普魯蘭酶，酶解時間5 min，調(diào)節(jié)pH值至6，在100℃下加熱20 min，待冷卻后，于4℃環(huán)境下分別老化處理 （0，6，12，18，24，30，36 h），測CYRS-RS3得率。

1.2.6 CYRS-RS3制備工藝優(yōu)化

基于上述單因素試驗，以CYRS-RS3得率為指標(biāo)，采用正交試驗對淀粉乳pH值（A）、普魯蘭酶用量（B）、酶處理時間（C）、壓熱溫度（D）、壓熱時間（E）、老化時間（F） 進(jìn)行優(yōu)化，確定制備CYRS-RS3最佳工藝參數(shù)。

正交試驗制備CYRS-RS3工藝因素與水平設(shè)計見表1。

表1 正交試驗制備CYRS-RS3工藝因素與水平設(shè)計

2 結(jié)果與分析

2.1 淀粉乳pH值對CYRS-RS3得率的影響

不同淀粉乳pH值對CYRS-RS3得率的影響見圖1。

由圖1可知，CYRS-RS3得率隨著pH值的上升先增后減，當(dāng)pH值6時其產(chǎn)率達(dá)到最大值，為11.6%±0.096%（p＜0.01）；繼續(xù)增大pH值，淀粉乳溶液逐步變?yōu)閴A性，不利于抗性淀粉的形成，導(dǎo)致CYRS-RS3得率下降。因此，制備淮山藥RS3抗性淀粉時其溶液pH值6.0為宜。

2.2 普魯蘭酶用量對CYRS-RS3得率的影響

采用普魯蘭酶處理淮山藥粉時，其主要作用于淮山藥淀粉的支鏈轉(zhuǎn)化為直鏈淀粉，從而促進(jìn)抗性淀粉的生成。

不同普魯蘭酶用量對CYRS-RS3得率的影響見圖2。

由圖2可知，CYRS-RS3得率隨著普魯蘭酶用量的增加呈先增大后減少的趨勢，當(dāng)酶用量達(dá)到180 U/g時，CYRS-RS3得率最高為14.7%±0.15%（p＜0.01）。但繼續(xù)增加普魯蘭酶用量時，支鏈淀粉脫支產(chǎn)生的短直鏈淀粉增加，不利于抗性淀粉的形成，CYRS-RS3得率反而下降。因此，制備淮山藥RS3抗性淀粉時普魯蘭酶用量選擇180 U/g左右為宜。

2.3 普魯蘭酶酶解時間對CYRS-RS3得率的影響

不同普魯蘭酶酶解時間CYRS-RS3得率的影響見圖3。

由圖3可知，采用180 U/g普魯蘭酶處理淮山藥粉所得CYRS-RS3得率為13.6%±0.19%，明顯高于未經(jīng)酶處理的CYRS-RS3得率為9.5%±0.13%（p＜0.01），說明普魯蘭酶處理有利于抗性淀粉的生成。但酶處理時間過長，由于短直鏈淀粉的生成量加大，反而不利于抗性淀粉的生成，CYRS-RS3得率持續(xù)下降。因此，制備淮山藥RS3抗性淀粉時普魯蘭酶處理時間選擇5min左右為宜。

2.4 壓熱溫度對CYRS-RS3得率的影響

壓熱溫度足夠高有助于淀粉的糊化，從而強(qiáng)化抗性淀粉的生成，但溫度過高可能會使淀粉結(jié)構(gòu)被破壞，從而弱化抗性淀粉的生成。

不同壓熱溫度對CYRS-RS3得率的影響見圖4。

由圖4可知，當(dāng)壓熱溫度達(dá)到100℃時，CYRSRS3得率最高為14.9%±0.21%（p＜0.05）；增加壓熱溫度，CYRS-RS3得率呈下降趨勢。因此，制備淮山藥RS3抗性淀粉時壓熱溫度選擇100℃左右為宜。

2.5 壓熱時間對CYRS-RS3得率的影響

熱處理時間是保證淀粉能否完全糊化的主要因素之一。

不同壓熱時間對CYRS-RS3得率的影響見圖5。

由圖5可知，當(dāng)壓熱時間達(dá)到20 min時，CYRS-RS3得率最高為16.9%±0.24%（p＜0.05）；繼續(xù)增加壓熱時間，CYRS-RS3得率反而下降。因此，制備淮山藥RS3抗性淀粉時壓熱時間選擇20 min左右為宜。

2.6 老化時間對CYRS-RS3得率的影響

淀粉糊化后的老化在低溫下進(jìn)行，是一個淀粉分子鏈重排的過程，該過程進(jìn)行相對緩慢。

不同老化時間對CYRS-RS3得率的影響見圖6。

由圖6可知，當(dāng)老化時間達(dá)到18 h時，CYRSRS3得率增至最高值17.8%±0.21%，但與12 h時CYRS-RS3得率17.4%±0.20%無顯著差異（p＞0.05）；繼續(xù)延長老化時間，CYRS-RS3得率無顯著變化（p＞0.05）。因此，制備淮山藥RS3抗性淀粉時老化時間至少應(yīng)該12 h以上為宜。

2.7 正交試驗結(jié)果分析

CYRS-RS3制備工藝條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析見表2，正交試驗結(jié)果方差分析見表3。

表2 CYRS-RS3制備工藝條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析

由表2可知，通過比較各因素極差R值大小，可知各因素對CYRS-RS3得率影響大小依次是E＞F＞C＞B＞D＞A，確定制備最佳因素水平為A1B3C1D3E3F4，即淮山藥淀粉乳pH值5.5，普魯蘭酶用量為180 U/g，酶解時間5 min，壓熱溫度109℃，壓熱時間20 min，老化時間18 h。

由表3可知，對CYRS-RS3制備的正交試驗進(jìn)行方差分析，其中加熱溫度因素在試驗水平內(nèi)對CYRS-RS3得率影響極顯著（p＜0.01），老化時間因素在試驗水平內(nèi)對CYRS-RS3得率影響顯著（p＜0.05），其他因素影響不顯著。

表3 正交試驗結(jié)果方差分析

以淮山藥淀粉乳pH值5.5，普魯蘭酶酶用量為180 U/g，酶解時間5 min，壓熱溫度109℃，壓熱時間20 min，老化時間18 h為制備CYRS-RS3的工藝參數(shù)進(jìn)行驗證試驗，所得CYRS-RS3得率為20.7%±0.26%。

2.8 CYRS-RS3消化率

淮山藥粉與CYRS-RS3在5 h內(nèi)的平均消化率見表4。

表4 淮山藥粉與CYRS-RS3在5 h內(nèi)的平均消化率/%

由表4可知，CYRS-RS3平均消化率為8.22%±0.3%，比淮山藥粉的平均消化率為12.7%±0.5%明顯降低（p＜0.01），說明酶解-壓熱法所制備的抗性淀粉比原淮山藥粉具有更強(qiáng)的抗消化能力。

3 結(jié)論

采用普魯蘭酶處理淮山藥粉以制備淮山藥RS3抗性淀粉過程中，淀粉溶液的pH值、酶用量、酶解時間等因素會影響CYRS-RS3得率。其中，當(dāng)?shù)矸廴芤禾幱谶m當(dāng)?shù)乃釅A度時能提高淀粉乳中直鏈淀粉的釋放，從而提高抗性淀粉得率，而堿性環(huán)境下，由于短直鏈淀粉的生成增多而不利于抗性淀粉的生成[24]；所采用的普魯蘭酶為脫支酶，作用對象為支鏈淀粉側(cè)鏈脫支轉(zhuǎn)化為直鏈淀粉，但酶處理過度，側(cè)鏈脫支過多，產(chǎn)生短直鏈淀粉增多反而不利于抗性淀粉的生成[25]；酶解時間太長，同樣會由于短直鏈淀粉生成量多而不利于抗性淀粉的生產(chǎn)[26]。

在抗性淀粉的制備過程中，需要將原淀粉進(jìn)行充分的糊化，以利于淀粉分子鏈解繞釋放直鏈淀粉，而淀粉糊化與其熱處理溫度和熱處理時間息息相關(guān)。適當(dāng)?shù)臒崽幚頊囟?，能有效地將淀粉分子鏈打亂而后發(fā)生重新聚合、卷曲、折疊現(xiàn)象，同時有助于糖苷鍵斷裂，以提高直鏈淀粉溶出率，從而增加抗性淀粉得率，但溫度過高容易引起淀粉二級螺旋結(jié)構(gòu)遭到破壞，內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露，從而影響抗性淀粉生成[27]；而研究發(fā)現(xiàn)熱處理時間不足，不利于直鏈淀粉從淀粉中分離，熱處理時間太長，容易產(chǎn)生大量的短直鏈淀粉，其運動相對激烈，不容易結(jié)晶凝沉，不利于抗性淀粉生成[28]。

經(jīng)糊化后的淀粉在低溫條件下其直鏈淀粉分子之間會發(fā)生自動重排，形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的結(jié)晶，從而制備出抗性淀粉，但此過程相對緩慢，需要較長時間才能完成，但老化時間太長也無助于生成更多的抗性淀粉[29]。

綜上所述，采用酶解-壓熱法制備淮山藥RS3抗性淀粉的最佳工藝條件為淮山藥淀粉乳pH值5.5，酶用量180 U/g，酶處理時間5 min，壓熱溫度109℃，壓熱時間20 min，老化時間18 h，且在該參數(shù)條件下的淮山藥RS3抗性淀粉得率為20.7%±0.26%。運用In-vitro消化模型，測得最佳工藝下的HYRS-RS3在5 h內(nèi)平均消化率為8.22%±0.3%顯著低于原淮山藥粉的平均消化率為12.7%±0.5%，結(jié)果表明以HYRS-RS3的為原料開發(fā)的新產(chǎn)品雖然具有一定抗消化特性，但試驗過程發(fā)現(xiàn)該方法制得的抗性淀粉容易使成產(chǎn)品風(fēng)味變得干澀、質(zhì)地較硬，整體口感變差，且可能不利于保證新產(chǎn)品的色澤，因此在實際運用中需要進(jìn)一步探究淮山藥RS3抗性淀粉理化性質(zhì)的改進(jìn)。