不同培養(yǎng)基對(duì)云煙97變異株腋芽培養(yǎng)的效應(yīng)研究

劉瑞婕　張麗瓊　李炳　陳佳荷　張子怡

摘 要：以云煙97變異株腋芽為外植體，研究不同培養(yǎng)基對(duì)云煙97變異株組織培養(yǎng)的效應(yīng)。結(jié)果表明，初代培養(yǎng)基MS+6-BA? 2.0 mg/L分化成芽率高達(dá)75 %;初代培養(yǎng)基MS+6-BA? 1.0 mg/L，繼代培養(yǎng)基MS+6-BA? 1.0 mg/L +NAA? 0.2 mg/L分化成芽率高達(dá)77 %;初代培養(yǎng)基MS+6-BA? 2.0 mg/L，繼代培養(yǎng)基MS+6-BA? 3.0 mg/L分化成芽率高達(dá)76 %。故利用植物快繁技術(shù)培養(yǎng)云煙97時(shí)，要根據(jù)初代培養(yǎng)基選擇相應(yīng)的繼代培養(yǎng)基。

關(guān)鍵詞：煙草 云煙97 變異株 腋芽 組織培養(yǎng)

中圖分類號(hào)：S572?????????? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Effects of Different Media on Culture of Axillary

Buds of Yunyan 97 Mutant

LIU Ruijie1，ZHANG Liqiong1，2*， LI Bing1， CHEN Jiahe1， ZHANG Ziyi1

（1School of Modern Agriculture and Biotechnology，Ankang University，Ankang，Shaanxi 725000，China;2 Research Center for Rural Revitalization in Southern Shaanxi， Ankang 725000，China）

Abstract： Axillary buds of Yunyan 97 mutant were used as explants to study the effects of different media on axillary buds formation of Yunyan 97 mutant. Results showed that the bud formation rate in the initial medium： MS+6-BA 2.0 mg/L was up to 75 %; in the initial medium： MS+6-BA 1.0 mg/L and the subculture medium： MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L reached 77 %; in the initial medium： MS+6-BA 2.0 mg/L and subculture medium： MS+6-BA 3.0 mg/L reached 76 %. It is suggested to select corresponding subculture medium based on initial medium to culture Yunyan 97 by rapid propagation technology.

Key words： Yunyan 97 mutant; axillary bud; culture medium

煙草是安康市鎮(zhèn)平縣主要的經(jīng)濟(jì)作物，也是植物生物技術(shù)研究的重要模式植物[1]，一直是植物分子遺傳學(xué)、植物生物工程學(xué)的主要研究對(duì)象[2]。Carlson等[3] 試驗(yàn)得到世界上第1個(gè)雜種植株。由于傳統(tǒng)種子優(yōu)良性狀退化，因此通過植物組織培養(yǎng)可以培養(yǎng)出大量植株。不斷優(yōu)化組織培養(yǎng)條件就成為不同煙草遺傳操作中不可缺少的基礎(chǔ)研究[4-6]。例如：在2001年10月，1株超大變異煙草在陜西旬陽(yáng)被發(fā)現(xiàn)，該變異株煙草比普通株有更大生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，陳剛[7]對(duì)這株變異煙草進(jìn)行組織培養(yǎng)并進(jìn)行測(cè)量分析來判斷這株是否為變異株。何余勇[8]等為了優(yōu)化云煙97變異株培育的快繁體系，采用不同激素濃度、配比處理云煙97變異株，結(jié)果顯示，MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA? 0.2 mg/L，是誘導(dǎo)愈傷組織和不定芽分化的最佳培養(yǎng)基，1/2MS+6-BA? 0.1 mg/L+IBA? 0.5 mg/L是最佳誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基。

近幾年，陜西省鎮(zhèn)平縣把煙草作為農(nóng)民經(jīng)濟(jì)收入的主要來源，經(jīng)過政府支持，烤煙種植取得成功，填補(bǔ)烤煙在該縣種植空白，帶動(dòng)了經(jīng)濟(jì)發(fā)展。2016年9月在陜西鎮(zhèn)平縣煙田中發(fā)現(xiàn)的2株云煙97超大型變異株，比當(dāng)?shù)卦耘嗟脑茻?7植株高，葉片產(chǎn)量高，同時(shí)還具有其他的優(yōu)良性狀，整株無病蟲害，從該株上采的煙葉質(zhì)量上乘。為了保存這一優(yōu)良的煙草種質(zhì)資源，本研究以云煙97變異株腋芽為材料，進(jìn)行了初代和繼代培養(yǎng)研究，探索云煙97組培快繁適宜的培養(yǎng)基配方。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

云煙97超大型變異株腋芽。

1.2 試驗(yàn)方法

以云煙97變異株腋芽為外植體，先用自來水沖洗掉外植體上面的泥土砂礫，再用蒸餾水沖洗3遍，放在干凈的燒杯中，在無菌操作室里面用70 %的酒精浸泡30 s，再用無菌水沖洗4遍。然后放入干凈的燒杯中用0.1 %的升汞浸泡6 min，再用無菌水沖洗5次，最后用刀片把外植體切成1 cm2小塊接種到培養(yǎng)基中。試驗(yàn)采取誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS及添加不同植物激素組合的固體培養(yǎng)基（表1）上誘導(dǎo)愈傷組織，每個(gè)三角瓶（100 mL）中接種四五塊葉片外植體，每處理30個(gè)重復(fù)。外植體培養(yǎng)條件為25 ℃，2000 Lux，每天14 h光照。

將愈傷組織上分化的葉片切成1 cm2大小轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基（表2）上誘導(dǎo)芽的分化和根的形成，每種處理10個(gè)重復(fù)，誘導(dǎo)條件為25? ℃，光照2000 Lux，14 h/d。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)中，設(shè)置不同激素組合，觀察對(duì)云煙97變異株組織培養(yǎng)的影響，記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，按照下面數(shù)據(jù)計(jì)算：

愈傷組織形成率（%）=形成愈傷組織外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100。

分化成芽率（%）=形分化明顯芽數(shù)/分化芽點(diǎn)總數(shù)×100。

污染率（%）=污染的外植體數(shù)/總外植體數(shù)×100。

褐變率（%）=褐變的外植體數(shù)/總外植體數(shù)×100。

2 結(jié)果分析

2.1 初代培養(yǎng)

接種后第15 d?? 3個(gè)處理的外植體生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯差異（表3）。比較第15 d至31 d的觀察結(jié)果，處理CK生長(zhǎng)無明顯變化;處理A和處理B均能誘導(dǎo)出愈傷組織和分化出叢生芽，但處理B生長(zhǎng)速度高于處理A。表明以云煙97腋芽為外植體快速繁殖時(shí)，初代培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L。

由生長(zhǎng)情況分化出芽和褐變統(tǒng)計(jì)分析可知，隨著6-BA濃度的增加，褐變率升高，分化成芽率升高（表4），表明高濃度的6-BA能促進(jìn)分化，同時(shí)也會(huì)加快外植體的褐變，故在培養(yǎng)時(shí)應(yīng)及時(shí)轉(zhuǎn)接。

2.2 繼代培養(yǎng)

繼代培養(yǎng)5 d后，處理A5和處理A11均比其他處理先分化出芽（表5），具有相同繼代培養(yǎng)基的處理B5和處理B11則沒有;繼代培養(yǎng)第25 d，處理A2、B5、B9除分化出芽外，還分化出根（表5），與具有相同繼代培養(yǎng)的處理B2、A5、A9則無根。即不同初代培養(yǎng)基培養(yǎng)的材料，在相同繼代培養(yǎng)基上表現(xiàn)出差異性，表明不同培養(yǎng)基可能造成誘導(dǎo)分化的葉片生理上有差異，從而導(dǎo)致繼代培養(yǎng)表現(xiàn)不同。

從總體趨勢(shì)上看，相同濃度NAA條件下，處理A組的分化成芽率均低于處理B組（表6），處理A組和處理B組結(jié)果均顯示NAA濃度為0.2 mg/L時(shí)分化成芽率高于不加NAA和NAA濃度為0.5 mg/L的培養(yǎng)基。

相同濃度6-BA條件下，處理A組的分化成芽率均低于處理B組（表7），處理A組中，6-BA濃度為1.0 mg/L和3.0 mg/L時(shí)分化成芽率高于不加6-BA和6-BA濃度為2.0 mg/L的培養(yǎng)基。處理B組中，6-BA濃度為3.0 mg/L的分化成芽率較高，其次是不添加6-BA的處理。表明初代培養(yǎng)基的不同，誘導(dǎo)出的愈傷組織在生理上有差異性，導(dǎo)致相同繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)的愈傷組織分化成芽率不同。

從初代培養(yǎng)到繼代培養(yǎng)，處理A5、處理A11、處理B10的分化成芽率較高，超過了70 %，即初代培養(yǎng)基為MS+適宜的培養(yǎng)基方案為：初代培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L，繼代培養(yǎng)基NAA濃度為0.2 mg/L、6-BA濃度為1.0 mg/L或3.0 mg/L;初代培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L，繼代培養(yǎng)基NAA濃度為0.2 mg/L、6-BA濃度為3.0 mg/L。

3 討論

在本次試驗(yàn)中，分別探討了6-BA濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響，6-BA、NAA濃度對(duì)誘導(dǎo)芽分化和伸長(zhǎng)影響等進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，初代培養(yǎng)中，處理CK分化成芽率為25 %，處理CK與處理A、B相比較，處理CK的分化成芽率最低。處理A次之，分化成芽率為67.5 %。處理B的分化成芽率最高，分化成芽率為75 %。說明 MS+6-BA 2.0 mg/L培養(yǎng)基誘導(dǎo)率比較高當(dāng)，這與陳剛的MS+6-BA 2.0 mg/L結(jié)果一致[7]。

繼代培養(yǎng)中，NAA濃度為0時(shí)，分化成芽率比較低，當(dāng)0.2 mg/L NAA濃度時(shí)，分化成芽率升高，但當(dāng)0.5 mg/L NAA濃度時(shí)，分化成芽率反而下降了，所以0.2 mg/L NAA濃度時(shí)，分化成芽率為 68 %;當(dāng)6-BA濃度為0時(shí)，分化成芽率比較低，1.0? mg/L 6-BA濃度時(shí)，分化成芽率升高為63 %。2.0 mg/L 6-BA濃度時(shí)，分化成芽率為59 %，6-BA濃度為3.0 mg/L，分化成芽率為76 %。因此當(dāng)6-BA濃度為3.0 mg/L，分化成芽率比較高;當(dāng)1.0? mg/L 6-BA濃度時(shí)，NAA濃度為0.2 mg/L時(shí)，分化成芽率為77 %，分化成芽率最高，這與陳剛的結(jié)果一致[7]。在B組處理中，3.0 mg/L的6-BA濃度時(shí)，0.2 mg/L 的NAA濃度時(shí)，分化成芽率為69 %。

4 結(jié)論

本研究在25 ℃，2000 Lux，每天14 h光照條件下培養(yǎng)云煙97變異株腋芽外植體。在初代培養(yǎng)中，MS+6-BA 2.0 mg/L培養(yǎng)基誘導(dǎo)效果優(yōu)于其他培養(yǎng)基組合，因此它是適宜誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基。在初代培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0 mg/L培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，繼代培養(yǎng)適宜的培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L;在初代培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0 mg/L培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，繼代培養(yǎng)適宜的培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg/L。

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基金項(xiàng)目：陜西省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（2017sxjy002）。

作者簡(jiǎn)介：劉瑞婕（1998-），女，籍貫陜西省榆林市綏德縣，本科，主要從事作物栽培研究。

通信作者：張麗瓊（1979-），女，籍貫云南省個(gè)舊市，副教授，博士，研究方向?yàn)橥寥牢镔|(zhì)循環(huán)，E-mail：yryzlq@163.com。

收稿日期：2020-04-02