鮮牛奶中丙酸桿菌的篩選、鑒定及特性分析

范小飄,高文文,李欣芮,趙 桉,趙鵬昊,尚佳萃,趙 樂(lè),周 雪,孟祥晨

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱150038)

丙酸桿菌是無(wú)芽孢、革蘭氏陽(yáng)性的兼性厭氧菌,主要存在于干酪、生牛奶及其他乳制品、青貯飼料、土壤中,最近有人在酒曲和窖泥中也分離到了丙酸桿菌[1]。丙酸桿菌作為益生菌的應(yīng)用極其廣泛,如食品發(fā)酵劑、抑制病原微生物、維持腸道菌群平衡、促進(jìn)其他益生菌增殖、抗炎、提高機(jī)體免疫力等益生功能[2-4],因此,研究人員常將丙酸桿菌作為微生態(tài)制劑添加到食品、藥品、飼料等多種領(lǐng)域以發(fā)揮多種益生作用。傳統(tǒng)上,丙酸桿菌被用作瑞士干酪的發(fā)酵劑,特別是費(fèi)氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudenreichii),在瑞士干酪成熟過(guò)程中,賦予干酪典型的大孔質(zhì)地和特征性的風(fēng)味[2],費(fèi)式丙酸桿菌謝氏亞種(P.freudenreichiisubsp.shermanii)JS最初分離自瑞士干酪,幾十年來(lái)一直作為芬蘭Jarlsberg干酪的發(fā)酵劑使用,該菌株還與鼠李糖乳桿菌 LC705聯(lián)合用作保護(hù)性發(fā)酵劑,用于發(fā)酵食品的生物防腐[5]。除此之外,丙酸桿菌能通過(guò)促雙歧桿菌生長(zhǎng)來(lái)調(diào)節(jié)腸道微生物菌群,并通過(guò)產(chǎn)生細(xì)菌素來(lái)保護(hù)機(jī)體免受病原微生物的侵染[6]。其與嗜酸乳桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌亞種組合,可用于生產(chǎn)益生菌飲料,感官評(píng)價(jià)表明上述微生物組合發(fā)酵可以生產(chǎn)風(fēng)味更好的飲料[7]。最新研究表明丙酸桿菌可粘附于腸上皮細(xì)胞具有調(diào)節(jié)腸粘膜的重要功能,并且其表面蛋白參與抗炎特性[4]。因此,丙酸桿菌是極具潛力，并對(duì)人們有利的益生菌。

丙酸桿菌的主要代謝產(chǎn)物為丙酸,又被稱作甲基乙酸,是一種重要的天然有機(jī)弱酸。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)為丙酸及其鈣、鈉和鉀鹽是一般公認(rèn)安全(Generally recognized as safe,GRAS)的食品添加劑,廣泛應(yīng)用于抗微生物劑[8]、抗炎劑[9]、食品防腐劑[10]、除草劑[11]和人造香料[12]等。近年來(lái),由于人們對(duì)天然食品和綠色添加劑需求的日益增加,通過(guò)微生物發(fā)酵生產(chǎn)丙酸獲得更多關(guān)注。Wang等[13]篩選到的一株費(fèi)氏丙酸桿菌,以葡萄糖為碳源時(shí),丙酸生成量為0.39 g/g,葉文彬等[14]獲得的一株丙酸桿菌,丙酸初始生成量為1.2 g/L。由此可見(jiàn),獲得高產(chǎn)丙酸的菌株對(duì)生產(chǎn)非常重要。因此,本實(shí)驗(yàn)旨在分離篩選獲得高產(chǎn)丙酸的菌株,并分析其基本生物學(xué)性質(zhì),以期為后續(xù)高產(chǎn)丙酸菌株的育種以及生物防腐菌種的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮生牛乳 黑龍江省哈爾濱市農(nóng)戶家奶牛;金黃色葡萄球菌(S.aureus)ATCC25923 中國(guó)藥品生物制品檢定所;丙酸(色譜純) 西亞試劑;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技有限公司;細(xì)菌微量生化反應(yīng)管 青島海博;藥敏紙片 上海源葉生物科技有限公司；引物合成 吉林庫(kù)美生物科技有限公司;其余試劑 均為分析純。

Opticlean-1300垂直流潔凈工作臺(tái) 力康精密科技(上海)有限公司;3K15離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司;光學(xué)顯微鏡 上海光學(xué)儀器廠;Uvmini-1240紫外分光光度計(jì) 日本島津公司;HPX-87H色譜柱 美國(guó)Bio-Rad公司;Waters2695高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 分離純化培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)[15]。

葡萄糖培養(yǎng)基:葡萄糖10 g,胰蛋白胨10 g,酵母浸粉10 g,加蒸餾水至1000 mL。固體培養(yǎng)基則添加1.8%～2.0%的瓊脂。調(diào)pH至6.9～7.0,121 ℃滅菌15 min。

甘油培養(yǎng)基:甘油10 g,胰蛋白胨10 g,酵母浸粉10 g,加蒸餾水至1000 mL。調(diào)pH至6.9～7.0,121 ℃滅菌15 min。

1.2.2 產(chǎn)丙酸菌的初篩 參照李燕波等[15]的方法,將新鮮生牛乳用磷酸鹽緩沖液(PBS)梯度稀釋并涂布于固體培養(yǎng)基上初步篩選產(chǎn)丙酸的菌株。

1.2.3 菌株的復(fù)篩 以總細(xì)菌數(shù)為1×108CFU/mL的接種量將初篩中獲得的菌株接種于葡萄糖液體培養(yǎng)基中,30 ℃厭氧培養(yǎng)120 h,取1.5 mL發(fā)酵液于EP管中,12000 r/min離心10 min,小心吸取上層發(fā)酵液,經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后,采用高效液相色譜分析方法測(cè)定發(fā)酵液中丙酸含量。

1.2.4 高效液相色譜 高效液相色譜條件參照Liu等[16]的方法稍作修改:色譜柱:Biorad Aminex HPX-87H 300 mm×7.8 mm;檢測(cè)器:紫外檢測(cè)器(210 nm);流動(dòng)相:5 mmol/L稀硫酸溶液;流動(dòng)相流速:0.5 mL/min;柱溫:50 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。測(cè)定丙酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為20.5 min,質(zhì)量濃度(g/L)與峰面積的回歸方程為:y=559847x+29157(式中,x代表質(zhì)量濃度g/L,y代表峰面積),其決定系數(shù)R2=0.9998。

1.2.5 分離株菌種鑒定

1.2.5.1 形態(tài)學(xué)特征 將篩選得到的產(chǎn)丙酸含量最高的菌株B1以總細(xì)菌數(shù)為1×108CFU/mL的接種量接種于葡萄糖液體培養(yǎng)基中,于30 ℃厭氧培養(yǎng)60 h,連續(xù)活化兩代后,梯度稀釋涂布于固體培養(yǎng)基中,30 ℃厭氧培養(yǎng)5 d后觀察其菌落形態(tài),并在超凈工作臺(tái)中挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色后,置于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.5.2 生理生化及糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》,對(duì)分離株進(jìn)行硝酸鹽還原試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、明膠水解試驗(yàn)、產(chǎn)氣、運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)以及糖發(fā)酵試驗(yàn)。

1.2.5.3 16S rDNA同源性分析 細(xì)菌基因組DNA的提取:按照天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書稍作修改進(jìn)行基因組DNA的提取;16S rDNA基因片段擴(kuò)增反應(yīng)的上下游引物、PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系以及擴(kuò)增條件參照張秋雪等[17]的方法。

PCR擴(kuò)增完成后,進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,若擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度在1500 bp左右且無(wú)雜帶,則將其送至測(cè)序公司進(jìn)行雙向測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)后,使用MEGA 7軟件并采用Neighbor-Joining方法將Bootstrap設(shè)置為1000,對(duì)分離株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.5.4 多位點(diǎn)序列分型(MLST) 本試驗(yàn)選取了在丙酸桿菌菌株鑒定中常用的7個(gè)管家基因[18]:pf169、fumC、pf1637、recA、gtf、rpoB、adk,其上下游引物信息見(jiàn)表1。

表1 丙酸桿菌MLST擴(kuò)增引物Table 1 The MLST primers for Propionibacterium

管家基因的PCR擴(kuò)增體系與16S rDNA基因的擴(kuò)增體系相同。其擴(kuò)增反應(yīng)條件如下:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s,58/59/60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,循環(huán)40次;最后72 ℃末端延伸10 min。其中管家基因pf169退火溫度為59 ℃,管家基因gtf退火溫度為60 ℃,其余管家基因退火溫度都為58 ℃。將7個(gè)管家基因的測(cè)序結(jié)果順序拼接并進(jìn)行Blast對(duì)比,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),進(jìn)一步分析分離株間的親緣關(guān)系。

1.2.6 分離株B1在不同培養(yǎng)基中生長(zhǎng)及丙酸生成量的測(cè)定

1.2.6.1 生長(zhǎng)曲線 以總細(xì)菌數(shù)為1×108CFU/mL的接種量將活化后的菌株分別接種于葡萄糖液體培養(yǎng)基以及甘油液體培養(yǎng)基中,30 ℃厭氧培養(yǎng)120 h,每間隔12 h取1次發(fā)酵液,紫外分光光度計(jì)測(cè)其OD600、pH計(jì)測(cè)其pH,然后以時(shí)間為橫坐標(biāo),OD600、pH分別為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.6.2 丙酸生成量的測(cè)定 以總細(xì)菌數(shù)為1×108CFU/mL的接種量將活化后的菌株分別接種于葡萄糖液體培養(yǎng)基以及甘油液體培養(yǎng)基中,30 ℃厭氧培養(yǎng)120 h,每間隔12 h各取發(fā)酵液1.5 mL,將發(fā)酵液離心處理(12000 r/min 10 min),仔細(xì)吸取發(fā)酵上清液,經(jīng)過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾后置于棕色進(jìn)樣瓶中,采用高效液相色譜(HLPC)方法測(cè)定丙酸含量。

1.2.6.3 葡萄糖殘留量的測(cè)定 以總細(xì)菌數(shù)為1×108CFU/mL的接種量將活化后的菌株接種于葡萄糖液體培養(yǎng)基中,30 ℃厭氧培養(yǎng)120 h,每間隔12 h取發(fā)酵液,參照彥繁鶴等[19]的試驗(yàn)方法測(cè)葡萄糖殘留量。測(cè)定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.8941x-0.0179(式中,x代表質(zhì)量濃度g/L,y代表吸光度值),其決定系數(shù)R2=0.9991。

1.2.6.4 甘油殘留量的測(cè)定 以總細(xì)菌數(shù)為1×108CFU/mL的接種量將活化后的菌株接種于甘油液體培養(yǎng)基中,30 ℃厭氧培養(yǎng)120 h,每間隔12 h取發(fā)酵液,參照張永生等[20]的試驗(yàn)方法測(cè)定甘油殘留量。測(cè)定甘油標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0266x+0.0222(式中,x代表質(zhì)量濃度g/L,y代表吸光度值),其決定系數(shù)R2=0.9997。

1.2.7 分離株B1體外安全性評(píng)價(jià)

1.2.7.1 溶血性實(shí)驗(yàn) 通過(guò)血平板培養(yǎng)法檢測(cè)Propionibacteriumfreudenreichiisubsp.shermanii是否具有溶血性。將連續(xù)活化兩代的分離株劃線于含質(zhì)量濃度為5%人血的哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基,放置厭氧罐中于30 ℃連續(xù)培養(yǎng)6 d,觀察菌落周圍是否有透明的溶血圈出現(xiàn)(β溶血)或綠色暈圈出現(xiàn)(α溶血)或無(wú)反應(yīng)(γ溶血),以此判斷受試菌株是否具有溶血性,同時(shí)以金黃色葡萄球菌(S.aureusATCC23957)作為陽(yáng)性對(duì)照菌株。

1.2.7.2 抗生素抗性實(shí)驗(yàn) 本試驗(yàn)采用藥敏紙片擴(kuò)散法。將待測(cè)菌株以總細(xì)菌數(shù)為1×108CFU/mL的接種量接種于葡萄糖液體培養(yǎng)基中,30 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后,在超凈工作臺(tái)中吸取0.1 mL菌懸液均勻涂布于固體培養(yǎng)基上,待培養(yǎng)基表面干燥后,分別鑷取含有不同抗生素的藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面(每個(gè)平板貼3張同一藥敏試紙并保持一定間距),30 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后,用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。依據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(NCCLS)的藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。不同抗生素的濃度及判定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 藥敏判定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Criterion of drug susceptibility

1.3 數(shù)據(jù)處理

以上所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)。運(yùn)用Origin 2018對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)繪圖,運(yùn)用SPSS 23進(jìn)行差異性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

采用高效液相色譜方法檢測(cè)了54株分離菌株培養(yǎng)上清中的丙酸含量,部分結(jié)果見(jiàn)表3,大多數(shù)菌株的丙酸含量在1.8～3.2 g/L,只有一株菌(B1)的含量達(dá)到7.38 g/L,顯著高于其他分離株(P<0.05),使用該菌株作為后續(xù)試驗(yàn)菌株。

圖2 基于16S rDNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree constructed based on 16S rDNA gene

表3 部分分離株培養(yǎng)上清中丙酸含量Table 3 Content of propionic acid in theculture supernatant of some isolates

2.2 分離株B1的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征 分離株在固體培養(yǎng)基中30 ℃厭氧培養(yǎng)6 d后,形成直徑1 mm左右、乳黃色菌落,微突起,不透明,邊緣整齊,表面濕潤(rùn)光滑(圖1A)。菌體革蘭氏染色陽(yáng)性,多為短桿狀,單在或成對(duì)存在,呈“v”字和“y”字形(圖1B)。

圖1 分離株B1菌落(A)及菌體(B)形態(tài)Fig.1 Colony(A)and cell morphology(B)of isolated strain B1

2.2.2 生理生化及糖發(fā)酵試驗(yàn) 經(jīng)過(guò)生理生化及糖發(fā)酵試驗(yàn),結(jié)果比對(duì)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》,初步鑒定分離株為費(fèi)氏丙酸桿菌(表4)。費(fèi)氏丙酸桿菌有兩個(gè)亞種:費(fèi)氏丙酸桿菌謝氏亞種(P.freudenreichiisubsp.shermanii)和費(fèi)氏丙酸桿freudenreichiisubsp.freudenreichii),前者可以利用乳糖但不還原硝酸鹽,而后者不能利用乳糖但可以還原硝酸鹽[18],利用這一特性可以區(qū)分兩個(gè)亞種,據(jù)此分析,本實(shí)驗(yàn)獲得的為P.freudenreichiisubsp.shermanii。

表4 分離株的生理生化和糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Physiological biochemical and sugar fermentation identification results of isolated strains

2.2.3 16S rDNA序列同源性分析 以分離株B1的DNA為模板,采用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段達(dá)1500 bp后送至測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),結(jié)果顯示分離株B1與費(fèi)氏丙酸桿菌親緣關(guān)系最近,同源性為100%(圖2)。

2.2.4 多位點(diǎn)序列分型(MLST) 以分離株B1的DNA為模板,對(duì)7個(gè)管家基因(pf169、fumC、pf1637、recA、gtf、rpoB、adk)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得7個(gè)300～600 bp左右長(zhǎng)度的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖3)。將7個(gè)管家基因序列依次串聯(lián)起來(lái),得到的片段長(zhǎng)度大約為3000 bp,經(jīng)Blast比對(duì)后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖4),結(jié)果顯示:分離株B1與Propionibacteriumfreudenreichiisubsp.shermaniiPFREUDJS1的同源性達(dá)到100%,結(jié)果進(jìn)一步表明:分離株B1為費(fèi)氏丙酸桿菌謝氏亞種。

圖4 基于七個(gè)等位基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree constructed based on seven alleles

圖3 等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.3 Agarose gel electrophoresis resultsof allele amplification prod注:M:D2000;1～7:管家基因1～7。

2.3 分離株B1的生長(zhǎng)及丙酸生成量

2.3.1 B1在含葡萄糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)及產(chǎn)酸情況 菌株B1在0～36 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,36 h后趨于穩(wěn)定期,到達(dá)穩(wěn)定期后,菌體量基本不變,其OD最終穩(wěn)定在2.4左右,當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間在84 h左右時(shí),pH最終穩(wěn)定在4.1左右(圖5A),而丙酸生成量此時(shí)達(dá)到7.0 g/L左右(圖5B)。培養(yǎng)120 h后，丙酸生成量達(dá)到7.38 g/L(圖5B)。

圖5 費(fèi)氏丙酸桿菌B1在含葡萄糖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)(A)和產(chǎn)丙酸(B)情況Fig.5 Growth(A)and propionic acid production(B)ofPropionibacterium freudenreichii B1 in glucose-containing medium

分析生長(zhǎng)期間葡萄糖的消耗發(fā)現(xiàn),0～72 h葡萄糖消耗速度較快,在第72 h時(shí),葡萄糖消耗了88%,其后的72～120 h葡萄糖消耗放緩,在發(fā)酵120 h結(jié)束時(shí),消耗了98.5%的葡萄糖(圖6)。

圖6 丙酸桿菌B1葡萄糖殘留量Fig.6 Glucose residue of Propionibacterium B1

2.3.2 B1在含甘油培養(yǎng)基中生長(zhǎng)及產(chǎn)酸情況 菌株B1在0～36 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,36 h后穩(wěn)定一段時(shí)間,在60 h后又有短暫的生長(zhǎng),72 h后到達(dá)穩(wěn)定期后,菌體量基本不變,其OD最終穩(wěn)定在1.5左右,最終pH在4.75左右(圖7A),丙酸生成量最終達(dá)到5.45 g/L左右(圖7B)。

圖7 費(fèi)氏丙酸桿菌B1在含甘油培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)(A)和產(chǎn)丙酸(B)情況Fig.7 Growth(A)and propionic acid production(B)ofPropionibacterium freudenreichii B1 in glycero-containing medium

分析生長(zhǎng)期間甘油的消耗得出(圖8),在0～36 h內(nèi),甘油被迅速消耗。其后甘油消耗緩慢,在發(fā)酵120 h后,甘油殘留量仍在5.9 g/L,僅消耗41%的甘油。說(shuō)明分離株B1在同等時(shí)間及培養(yǎng)條件下利用甘油生長(zhǎng)及生成丙酸的能力較弱。

圖8 丙酸桿菌B1甘油殘留量Fig.8 Glycerin residue of Propionibacterium freudenreichii B1

2.4 分離株B1安全性的體外評(píng)價(jià)

2.4.1 溶血性 陽(yáng)性對(duì)照菌S.aureusATCC25923在血瓊脂平板上菌落較大,凸起,淡黃色不透明,菌落周圍出現(xiàn)明顯的透明溶血圈(圖9B);而費(fèi)氏丙酸桿菌B1在血瓊脂平板上無(wú)反應(yīng)現(xiàn)象,菌落較小,表明該菌株不具有溶血性(圖9A)。

圖9 丙酸桿菌B1(A)和S. aureus ATCC25923(B)在血瓊脂平板上的生長(zhǎng)Fig.9 Hemolytic test of Propionibacterium B1(A)and S. aureus ATCC25923(B)

2.4.2 抗生素敏感性 本試驗(yàn)檢測(cè)了費(fèi)氏丙酸桿菌B1對(duì)10種抗生素的敏感性,并將S.aureusATCC25923作為質(zhì)控菌株。結(jié)果表明:該菌對(duì)氨芐西林、四環(huán)素、萬(wàn)古霉素、氯霉素、克林霉素敏感,對(duì)卡那霉素、慶大霉素等氨基糖苷類抗生素具有抗性,此外對(duì)頭孢呋辛、青霉素也具有抗性(表4),需要進(jìn)一步評(píng)價(jià)其抗生素抗性機(jī)制及抗性轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。

表5 丙酸桿菌B1對(duì)抗生素的敏感性Table 5 Sensitivity of Propionibacterium B1 to antibiotics

3 討論

從新鮮生牛奶中通過(guò)選擇性培養(yǎng)基,分離得到一株產(chǎn)丙酸的費(fèi)氏丙酸桿菌B1,除分析了其形態(tài)特征、生理生化和糖發(fā)酵特性之外,還采用MLST方法分析了這株菌的系統(tǒng)發(fā)育特點(diǎn)。基于MLST方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)與16S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)相比,可以更精確地反映出物種及物種間的進(jìn)化關(guān)系[21]。Delmasso等[18]將113種不同起源的費(fèi)氏丙酸桿菌亞種通過(guò)MLST分型分為46種序列類型(ST),說(shuō)明費(fèi)氏丙酸桿菌的分子多樣性和種群結(jié)構(gòu)。Mekadim等[21]針對(duì)11株丙酸桿菌,比較了16S rRNA同源性分析和選取3個(gè)管家基因進(jìn)行的MLST分析,分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),發(fā)現(xiàn)三種基因的可變區(qū)具有更高的分辨力。本實(shí)驗(yàn)選取了7個(gè)管家基因,分辨效果更好。

碳源種類顯著影響丙酸桿菌的丙酸生成量,Wang等[13]篩選到的一株費(fèi)氏丙酸桿菌,以葡萄糖為碳源時(shí),丙酸生成量為0.39 g/g,葉文彬[14]獲得的一株酸性丙酸桿菌,在以葡萄糖為碳源時(shí),丙酸初始生成量為1.2 g/L。本試驗(yàn)獲得的費(fèi)氏丙酸桿菌,同樣以葡萄糖為碳源時(shí),丙酸產(chǎn)量最高達(dá)到7.59 mg/mL,顯著高于現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道。丙酸桿菌代謝產(chǎn)物中主要抑菌物質(zhì)即為丙酸,鄭麗雪等[22]研究發(fā)現(xiàn)費(fèi)氏丙酸桿菌在乳酸鈉培養(yǎng)基發(fā)酵時(shí),該菌株代謝產(chǎn)物的抑菌活性結(jié)果要優(yōu)于山梨酸鉀的抑菌活性。因而篩選一株高產(chǎn)丙酸的菌株十分重要。

理論上,培養(yǎng)基中葡萄糖和甘油在重量相同時(shí),甘油發(fā)酵可生成更多的丙酸,通常,1 mol甘油通過(guò)EMP途徑產(chǎn)生1 mol丙酸而不產(chǎn)生乙酸,理論上丙酸產(chǎn)量為0.80 g/g;而1 mol葡萄糖通過(guò)EMP途徑產(chǎn)生4/3 mol丙酸和2/3 mol乙酸,理論上丙酸產(chǎn)量為0.55 g/g[13]。但由于甘油發(fā)酵會(huì)出現(xiàn)氧化還原失衡,導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)減少和丙酸生成量下降[23],因此,分離株B1在葡萄糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀況較好,并且產(chǎn)生更多的丙酸。

菌株抗生素抗性具有轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn),因此對(duì)于具有應(yīng)用潛力的菌株需要評(píng)價(jià)其抗生素抗性。Suomalainen等[24]評(píng)價(jià)了P.freudenreichiissp.shermaniiJS和P.freudenreichiisubsp.freudenreichii131的抗生素抗性,結(jié)果顯示菌株對(duì)氨芐青霉素、紅霉素、維吉霉素、四環(huán)素、氯霉素、萬(wàn)古霉素、甲基鹽霉素、桿菌肽敏感;對(duì)鏈霉素、慶大霉素和卡那霉素具有抗性。Monika等[25]也發(fā)現(xiàn)菌株P(guān).jensenii對(duì)慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素具有抗性,對(duì)其他類抗生素都敏感。Derya等[26]發(fā)現(xiàn)29種丙酸桿菌菌株都對(duì)萘啶酸(naldixic acid)有抗性,對(duì)慶大霉素、卡那霉素、利福平、多粘菌素耐藥性低,對(duì)其它抗生素敏感。上述研究結(jié)果表明:丙酸桿菌對(duì)卡那霉素等氨基糖苷類抗生素的抗性是厭氧細(xì)菌的共同特征,因?yàn)樗鼈內(nèi)狈?xì)胞色素介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)[27]。本研究的費(fèi)氏丙酸桿菌B1也具有這一特點(diǎn),但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)該菌對(duì)頭孢呋辛及青霉素也具有抗性,需要進(jìn)一步分析耐藥機(jī)制以及耐藥性轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。

4 結(jié)論

從生牛奶中分離得到一株費(fèi)氏丙酸桿菌,生長(zhǎng)周期大約為120 h,0～36 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,36 h后趨于穩(wěn)定期。發(fā)現(xiàn)其對(duì)葡萄糖的利用率大于對(duì)甘油的利用率,在含葡萄糖的培養(yǎng)基中于30 ℃厭氧培養(yǎng)120 h后丙酸產(chǎn)量達(dá)到7.38 g/L。該菌株無(wú)溶血性,對(duì)卡那霉素等氨基糖苷類抗生素有耐藥性,對(duì)青霉素和頭孢呋辛也具有抗性,而對(duì)氨芐西林、萬(wàn)古霉素、氯霉素、克林霉素、四環(huán)素敏感。需進(jìn)一步評(píng)價(jià)其耐藥基因的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。以上初步研究結(jié)果表明丙酸桿菌B1具有潛在的應(yīng)用價(jià)值,但在使用之前應(yīng)更全面地評(píng)估該菌株的安全性和益生功能。