玉米軸色突變體698-3R的遺傳鑒定

余學(xué)杰，李開兵,，張 玉,，柯永培，蔡 林，石海春

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,成都 611130；2.四川農(nóng)大正紅生物技術(shù)有限責(zé)任公司,成都 610213；3.貴州畢節(jié)市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,貴州畢節(jié) 551700；4.山東鑫豐種業(yè)有限公司,山東聊城 252400)

種質(zhì)資源是玉米育種的物質(zhì)基礎(chǔ)，玉米種質(zhì)資源的研究工作一直被高度重視[1-4]。廣泛應(yīng)用輻射誘變創(chuàng)制新的玉米種質(zhì)資源，直至選育新品種，是突破玉米育種實踐中資源遺傳基礎(chǔ)狹窄瓶頸的可能技術(shù)之一[5-7]。玉米自交系698-3自身綜合性狀優(yōu)良，已組配出10多個雜交種，在生產(chǎn)應(yīng)用上取得了顯著的社會經(jīng)濟效益[8]，用它作為基礎(chǔ)材料進行改良，創(chuàng)制新的優(yōu)良玉米種質(zhì)資源的可能性較大。本試驗以用60Co-γ射線輻射誘變處理玉米自交系698-3獲得的一份紅軸突變體698-3R為材料，研究其軸色遺傳規(guī)律，定位控制該軸色基因，并對其候選基因進行克隆和表達分析，為該突變體的進一步應(yīng)用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

玉米自交系698-3(P1)，以及用60Co-γ射線輻射該自交系而獲得的一份遺傳穩(wěn)定的紅軸突變體，暫命名為698-3R(P2)，正、反交F1、B1、B2和F2群體，均由四川正紅生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。其中，經(jīng)多年田間種植鑒定，親本698-3和698-3R除軸色有明顯差異外，其余主要農(nóng)藝經(jīng)濟性狀無顯著差異。

1.2 試驗方法

1.2.1 田間試驗 在四川和海南構(gòu)建正交F1(P1×P2)、反交F1(P2×P1)、B1正交[(P1×P2)×P1]、B1反交[(P2×P1)×P1]、B2正交[(P1×P2) ×P2]、B2反交[(P2×P1) ×P2]和F2群體。在公司雙流育種基地種植親本P1、P2，F(xiàn)1正反交群體，B1、B2正反交群體和F2群體。其中親本和正反交F1代，6行區(qū)，每行7穴，每穴2株定苗，種植密度50 000株/hm2，每個分離群體種植1個果穗的全部種子，每穴播種3粒，不間苗。田間考察所有群體果穗的軸色。

1.2.2 紅軸基因定位 定位群體為F2代正反交群體，在5～6片葉時，田間取親本P1、P210株幼嫩葉片混合，F(xiàn)2正反交群體同時單株取樣，DNA提取采用2×CTAB法，15 μL PCR反應(yīng)體系，用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳擴增產(chǎn)物，銀染法檢測[9]。根據(jù)F2群體穗軸顏色，參照Michelmore等[10]提出的分離群體分組分析法(Bulked segregant analysis,BSA)，在F2群體中隨機選取紅軸和白軸各10個單株，分別取等量DNA混合，建成紅軸基因池和白軸基因池。根據(jù)在紅、白池間篩選的SSR引物情況，對在兩池間多態(tài)性表現(xiàn)穩(wěn)定的SSR標(biāo)記，用F2代正反交群體中全部白軸單株進行PCR擴增，統(tǒng)計白軸單株對應(yīng)的SSR多態(tài)性結(jié)果，用紅軸單株做驗證。將具有白軸698-3帶型的單株記為A，具有紅軸698-3R帶型的單株記為B，具有雙親本雜合帶型的單株記為H，用MAPMARKER 3.0軟件對F2分離群體的軸色性狀和分子標(biāo)記的分離數(shù)據(jù)進行連鎖分析，利用Kosambi函數(shù)將重組率轉(zhuǎn)化為遺傳距離(cM)[11]。

1.2.3 候選基因克隆 根據(jù)遺傳分析與基因定位結(jié)果，在MaizeGDB上搜索定位區(qū)段附近軸色相關(guān)基因，根據(jù)結(jié)果基因模型為模版使用Oligo 7設(shè)計引物，Trizol 法提取穗軸穎片總RNA，PCR擴增目的基因片段，將目的片段連入T5載體(pEASY○R-T5 Zero Cloning Kit，購自TRANS)，挑單克隆重復(fù)測序，使用DNAMAN對測序結(jié)果比對，IBS 1.0序列圖繪制軟件比對結(jié)果作圖。

1.2.4 表達分析 取698-3R和698-3自然授粉后5、10、15、20和25 d(DAP)的穗軸穎片；Trizol 法提取總RNA，TaKaRa試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)去除基因組DNA與反轉(zhuǎn)錄，SYBR熒光染料法(UltraSYBR Mixture 試劑盒，康為世紀(jì)生物科技有限公司)，基因相對表達量計算采用Livak等[12]方法，利用Excel 2007進行相對表達量作圖；PCR反應(yīng)在C1000TMThermal Cycler PCR儀上進行，CFX96 Real-Time System進行熒光收集；內(nèi)參為β-Actin；每個時期各材料均取3株樣，做3次技術(shù)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體698-3R軸色的遺傳規(guī)律

對各群體果穗軸色分離情況進行統(tǒng)計分析(表1)表明：所有698-3果穗均為白軸，698-3R、正反交F1果穗和以698-3R為輪回親本的2個回交B2群體的果穗均表現(xiàn)為紅軸，說明698-3R紅軸性狀受細胞核顯性基因控制；2個正反交F2群體的果穗出現(xiàn)分離，經(jīng)χ2檢驗，紅軸與白軸符合 3∶1分離比例，2個回交B1群體則符合1∶1分離比例，所有正反交組合軸色分離比例一致，不受細胞質(zhì)效應(yīng)影響，表明該突變體穗軸顏色是受1對核基因控制，將該基因暫定名為C(t)。

表1 各群體軸色表現(xiàn)Table 1 Segregation of cob color in each population

2.2 突變體698-3R軸色基因的分子標(biāo)記定位

2.2.1 多態(tài)性引物篩選 首先選用均勻分布于玉米10條染色體上的475對SSR引物，檢測698-3R與698-3的基因組DNA擴增差異，共篩選出18對在親本間表現(xiàn)多態(tài)性穩(wěn)定且重復(fù)性好的SSR引物(表2),用它們在紅、白軸基因池間進行多態(tài)性篩選，結(jié)果顯示，只有引物umc2225在兩基因池間表現(xiàn)多態(tài)性。

表2 兩親本間表現(xiàn)多態(tài)性 SSR 引物Table 2 Polymorphism of SSR primers in two parents

2.2.2C(t)基因的分子標(biāo)記初步定位 用位于引物umc2225附近的29對SSR引物，以及與控制玉米軸色基因P1相連鎖的10對引物，進行親本和兩池間的多態(tài)性篩選，結(jié)果進一步篩選出3對SSR引物具有多態(tài)性，它們是umc2224、umc1452和phi095(圖1，表3)。然后用這4對候選標(biāo)記對F2正反交群體中共計122個白軸單株進行PCR擴增，其檢測結(jié)果為，phi095表現(xiàn)為116個698-3帶型，5個698-3R帶型，1個雙親本雜合帶型；umc1452表現(xiàn)為95個698-3帶型，0個698-3R帶型，17個雙親本雜合帶型，10個空白；umc2225表現(xiàn)為57個698-3帶型，13個698-3R帶型，49個雙親本雜合帶型，3個空白；umc2224在122個白軸DNA中擴增條帶表現(xiàn)為83個698-3帶型，5個698-3R帶型，22個雙親本雜合帶型，12個空白。用引物phi095對其隨機選取的20個F2紅軸單株DNA進行驗證，其擴增條帶均表現(xiàn)為698-3R帶型。利用MAPMAKER 3.0作圖軟件對篩選出的在雙親和兩池間表現(xiàn)多態(tài)性的SSR引物進行連鎖分析，利用Kosambi函數(shù)將重組率轉(zhuǎn)化為遺傳距離(cM)。根據(jù)F2定位群體的軸色和微衛(wèi)星標(biāo)記的分離數(shù)據(jù)構(gòu)建局部分子連鎖圖(圖2)，結(jié)果表明軸色突變基因C(t)位于第一染色體短臂上phi095與umc1452之間，與phi095相距3.9 cM，與umc1452相距7.1 cM，與umc2225相距23.5 cM，與umc2224相距70.1 cM。

2.3 紅軸基因C(t)的候選基因克隆

2.3.1C(t)候選基因的選擇 根據(jù)定位結(jié)果，在數(shù)據(jù)庫MaizeGDB上搜索關(guān)于穗軸顏色相關(guān)基因，僅有Pericarpcolor1(P1)，ID：GRMZM2G084799。P1基因控制玉米種皮和穗軸的著色，由兩個后綴字母表示其在種皮和穗軸穎上的表達，例如P1-rw和P1-wr分別表示紅色種皮白色穗軸和白色種皮紅色穗軸。標(biāo)記phi095與P1基因緊密連鎖，本研究定位結(jié)果顯示C(t)與該標(biāo)記也存在連鎖關(guān)系，且在染色體上與P1基因位于該標(biāo)記同側(cè)，遺傳模式分析顯示C(t) 為紅軸對白軸為顯性遺傳，與P1基因一致，因此以P1作為候選基因開展研究(NCBI登錄號：NM_001291678)。

P1、P2、W1、R1分別為698-3、698-3R、白池、紅池；W、R分別為F2群體白軸單株、紅軸單株；*為交換單株

表3 引物名稱和序列Table 3 Name and sequence of primers

圖2 基因C(t)的定位結(jié)果Fig.2 Genetic mapping of gene C(t)

2.3.2C(t)基因的cDNA克隆 從698-3R的15DAP時期的穗軸穎片轉(zhuǎn)錄物中，引物 Pc4F/Pc4R(序列見表3)擴增并克隆測序后獲得3個轉(zhuǎn)錄本，分別是698-3R-cDNA1、698-3R-cDNA2和698-3R-cDNA3，序列比對見圖3。從圖3可知，3個cDNA在不同位置上有差異，但均具有完整的起始密碼子和終止密碼子。從698-3的15DAP時期的穗軸穎片轉(zhuǎn)錄物中，引物Pc4F/Pc4R無法獲得產(chǎn)物，而引物EP5-8/EP3-10(序列見表3)擴增并克隆測序獲得1個382 bp的片段698-3-cDNA1(圖3)，與698-3R-cDNA1相比，698-3-cDNA1在第415個堿基開始有一個521 bp片段的缺失，這直接導(dǎo)致移碼突變(如圖4中的698-3-P-1)。而引物qP4F/qP4-3R(序列見表3)對698-3的15DAP時期的穗軸轉(zhuǎn)錄物擴增并克隆測序，結(jié)果如圖3，698-3中至少存在2個c(t)轉(zhuǎn)錄本，698-3-cDNA2和698-3-cDNA3，且僅在1403堿基處有不同，與698-3R的3個轉(zhuǎn)錄本在此處堿基差異一致。從698-3中克隆出來的c(t)轉(zhuǎn)錄本均不完整，除了698-3-cDNA1包含翻譯起始密碼子外，698-3-cDNA2和698-3-cDNA3均位于第三外顯子上，位于模板的1 341～1 420的位置，且3個轉(zhuǎn)錄本均不包含終止密碼子。

2.3.3c(t) 基因缺失位點鑒定 使用4對引物(qP5F/qP4-2R、qP4F/qP4-3R、qP4F/qP4-2R和qP4F/qP4-1R，位置如圖4所示，序列見表3)對698-3R和698-3穗軸穎片的轉(zhuǎn)錄物進行擴增，這4對引物在698-3R中均能擴增，而698-3中則只有qP4F/qP4-3R能擴增，根據(jù)這些引物位置，推測c(t)的轉(zhuǎn)錄本在引物qP4-1R到qP4-2R所對應(yīng)的位置可能有突變，位于模板1 461-1 513處(圖4中虛線區(qū)段所示)。對qP4F/qP4-3R擴增片段連入克隆載體進行測序，序列差異結(jié)果如上述中的698-3-cDNA2和698-3-cDNA3。

NM-001291678是NCBI上 P1-rr等位的cDNA；698-3R-cDNA1、698-3R-cDNA2和698-3R-cDNA3是C(t)在698-3R中的3個轉(zhuǎn)錄本；698-3-cDNA1、698-3-cDNA2和698-3-cDNA3是c(t)在698-3中的3個轉(zhuǎn)錄本

M.DL 2000 DNA marker；1和2分別表示紅軸突變體698-3R和白軸自交系698-3；引物qP5F/qP4-2R、qP4F/qP4-3R、qP4F/qP4-2R、qP4F/qP4-1R和β-Actin擴增的產(chǎn)物的目的長度分別為182、80、142、173和217 bp。

2.3.4 C(t)蛋白氨基酸序列分析 使用DNAMAN預(yù)測698-3R-cDNA1、698-3R-cDNA2、698-3R-cDNA3和698-3-cDNA1編碼蛋白的氨基酸序列并比對，結(jié)果如圖5所示。在698-3R中，僅有698-3R-cDNA3編碼的蛋白698-3R-P-3在C末端有1個丙氨酸(A)插入，另外2個轉(zhuǎn)錄本預(yù)測的氨基酸序列與已知的 P1-wr蛋白的氨基酸序列完全一致，且預(yù)測的3個蛋白均具有完整的MYB結(jié)構(gòu)域(第12～115個殘基，如圖5虛線所示)和酸性激活域(第201～244個殘基，如圖5實線所示)的氨基酸序列。而698-3的轉(zhuǎn)錄本698-3-cDNA1預(yù)測的698-3-P-1蛋白由于缺失導(dǎo)致移碼突變，該突變區(qū)域剛好位于上述2個功能結(jié)構(gòu)區(qū)段(如圖5的698-3-P-1所示)。說明，698-3R的3個轉(zhuǎn)錄本預(yù)測的蛋白可能與P1-wr蛋白功能一致，而與698-3的轉(zhuǎn)錄本預(yù)測的蛋白的功能不一樣。

NP-001278607、AAU09456和ACS44752分別是NCBI上P1-rr、P1-rw和P1-wr蛋白氨基酸序列；698-3R-P-1、698-3R-P-2、698-3R-P-3和698-3-P-1分別由698-3R-cDNA-1、698-3R-cDNA-2、698-3R-cDNA-3和698-3-cDNA1通過DNAMAN軟件預(yù)測的氨基酸序列；虛線所指示區(qū)域為MYB結(jié)構(gòu)域，實線所指示區(qū)域為酸性激活域

2.3.5C(t)的qRT-PCR結(jié)果分析 根據(jù)C(t)基因克隆結(jié)果，4對引物中只有qP4F/qP4-3R在698-3R和698-3的轉(zhuǎn)錄物中均能進行擴增(圖4)，因此選擇這對引物進行C(t)基因的相對表達量分析。結(jié)果如圖6，各時期C(t)基因在698-3R中的表達量均高于698-3，除25DAP外，其余4個時期表達水平均呈現(xiàn)顯著或極顯著差異(P= 0.004、0.001、0.001和0.036)。P1基因是一個MYB轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，根據(jù)其在糅紅色素合成過程中調(diào)控對A1和C2基因具有激活調(diào)控表達的功能，本研究選A1和C2基因進行表達驗證，引物分別為qA11F/qA11R和qC21-1F/qC21R(序列見表3)，結(jié)果如圖6所示。A1和C2基因的表達模式與C(t) 基因一致，說明C(t)可能具有P1激活調(diào)控A1和C2基因的功能。

3 討論與結(jié)論

3.1 突變體698-3R軸色的遺傳規(guī)律

育種實踐中多認為玉米軸色為質(zhì)量性狀，即由一對基因控制，如曹冰等[13]研究表明玉米軸色受一對基因控制, 其中紅軸對白軸為顯性；而豐光等[14]研究認為，玉米軸色性狀遺傳為少數(shù)主基因控制，符合加性-顯性-上位性兩對主基因遺傳模型。本研究表明，突變體698-3R的軸色性狀受一對核基因控制，且紅軸對白軸為顯性遺傳，其結(jié)果與曹冰等[13]研究一致，將該基因暫定名為C(t)。

3.2 突變體698-3R軸色基因C(t)的初步定位結(jié)果

Frascaroli 等[15]研究表明玉米穗軸顏色是由位于染色體1.03位置的P1基因所控制，到現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)的玉米軸色突變基因有P1-vv[16]、c1[17]、P1-wrb[18]、P1-www[19]、P1-ovov[20-21]、P1-mm[22]、P1-pr[23-24]、ufo1[25]、r1等。本研究將突變體698-3R軸色突變基因C(t)，初步定位于玉米第一染色體上phi095與umc1452之間，與phi095相距3.9 cM，與umc1452相距7.1 cM。Veldboom等[26]研究表明，phi095與P1基因緊密連鎖，而紅軸突變基因C(t)與phi095相距較近，推測該基因與控制種皮色和軸色的主要基因P1之間存在緊密連鎖。

*表示在0.05水平差異顯著，**表示在0.01水平差異顯著

3.3 突變體698-3R軸色基因C(t)的克隆結(jié)果

P1編碼一個MYB轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，調(diào)控玉米的種皮、穗軸及其他花器官的著色。P1不同等位間的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量有較大差異，P1-rr被認為只有一個轉(zhuǎn)錄本，而P1-wr存在多個拷貝[27-28]，這些拷貝并非可變剪切所致，而是由P1基因的復(fù)制形成了串聯(lián)重復(fù)[18]。本試驗結(jié)果顯示，在698-3R轉(zhuǎn)錄物中檢測到了3個C(t)轉(zhuǎn)錄本，而白軸的698-3至少2個，這與P1基因存在多轉(zhuǎn)錄本的結(jié)果一致。698-3R的3個轉(zhuǎn)錄本雖然在5′UTR和 3′UTR存在差異，但預(yù)測編碼氨基酸序列基本一致；698-3的轉(zhuǎn)錄本中，一個521 bp片段的缺失以及在1 461～1 513可能的缺失，直接影響預(yù)測編碼蛋白的氨基酸序列以及蛋白功能。Zhang等[28]和Chopra等[29]認為P1等位的表達模式不同，與編碼蛋白質(zhì)的C末端結(jié)構(gòu)差異有關(guān)。預(yù)測C(t)蛋白氨基酸序列與已知 P1-rr與P1-wr蛋白比對也發(fā)現(xiàn)，C(t)蛋白與P1-rr蛋白在C末端存在較大差異，與P1-wr蛋白一致。因此推測C(t)可能為一個P1-wr基因，根據(jù)P1基因控制種皮、穗軸顏色命名規(guī)則，C(t) 則為一個P1-ww基因。P1基因研究中未提及過P1-ww的cDNA克隆，多為對基因組中的基因結(jié)構(gòu)分析，本研究在698-3轉(zhuǎn)錄物中未能成功獲得C(t)轉(zhuǎn)錄本全長，可能與其結(jié)構(gòu)和表達有關(guān)[28, 30]。

3.4 突變體698-3R軸色基因C(t)的表達功能

只要存在適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)劑，幾乎在每個植物器官中都可以發(fā)現(xiàn)3-羥基黃酮及其衍生色素花青素[31]，相比之下，玉米中的3-脫氧類黃酮僅在種皮、穗軸及雄穗穎片等部分花器官中發(fā)現(xiàn)，在成熟的種皮和穗軸中，3-脫氧黃酮聚合形成紅色糅紅色素[32]。玉米P1基因是生物合成3-脫氧黃酮和糅紅色素所必需，但不能用于3-羥基類黃酮和花青素的合成[33]。糅紅色素的生物合成開始于三個丙二酰輔酶A與一個對香豆酰輔酶A經(jīng)Colorless2(C2)[34]基因編碼的查爾酮合酶(CHS)縮合形成柚皮素查耳酮，隨后由Chalcone flavanone isomerase1(Chi1)[35]基因編碼的查耳酮異構(gòu)酶(CHI)將柚皮素查耳酮轉(zhuǎn)化為柚皮素，在此產(chǎn)生關(guān)鍵的分支步驟。玉米中的糅紅色素是由柚皮素或圣草酚通過由玉米Anthocyaninless1 (A1)[36]基因編碼的二氫黃酮醇還原酶(DFR)產(chǎn)生的4-黃烷醇或黃酮醇的聚合物，在此過程中，C2和A1受P1基因激活與表達量的調(diào)控[37]，本研究結(jié)果顯示，A1和C2基因的表達模式與C(t)基因一致，這與Grotewold等[37-38]的研究結(jié)果相符，表明C(t)具有MYB調(diào)控功能，這也更說明了C(t)蛋白具有激活調(diào)控的功能。不同的P1等位基因有著不同的著色模式，P1等位間的糅紅色素的發(fā)生和表達強度存在著很大差異，其轉(zhuǎn)錄本的積累時間與可見色素的形成相關(guān)[30]，P1-rr轉(zhuǎn)錄物的積累始于雌穗發(fā)育的早期階段，6DAP、9DAP和15DAP表達強烈[39]，C(t)的轉(zhuǎn)錄水平規(guī)律與之基本相符，但P1-rr在穗軸6DAP表達量最高，而C(t)則在10DAP時表達量最高，Zhang等[30]也有相同結(jié)果，可能是由于P1等位間表達模式存在差異導(dǎo)致。