左旋紫草素對(duì)順鉑耐藥人宮頸癌HeLa細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用研究

杜春雙 馬亞妮 王帥 張飛 張潔 桑廣健

摘 要 目的：探討左旋紫草素（L-SHK）對(duì)順鉑（DDP）耐藥人宮頸癌HeLa細(xì)胞（HeLa/DDP）的逆轉(zhuǎn)作用及其可能機(jī)制。方法：以人宮頸癌HeLa細(xì)胞株為研究對(duì)象，以DDP誘導(dǎo)獲得HeLa/DDP耐藥細(xì)胞;采用CCK-8法測(cè)定HeLa/DDP細(xì)胞的耐藥指數(shù)以及不同劑量L-SHK（0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16 μmol/L）對(duì)該細(xì)胞的抑制率、半數(shù)抑制濃度（IC50）和逆轉(zhuǎn)倍數(shù);采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)低、中、高劑量L-SHK（0.3、0.6、1.2 μmol/L）聯(lián)合DDP對(duì)HeLa/DDP細(xì)胞周期及凋亡率的影響，采用Western blotting法檢測(cè)低、中、高劑量L-SHK（0.3、0.6、1.2 μmol/L）聯(lián)合DDP對(duì)HeLa/DDP細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白[剪切型胱天蛋白酶3（Cleaved caspase-3）、Bcl-2、Bax]表達(dá)的影響。結(jié)果：所得HeLa/DDP細(xì)胞的耐藥指數(shù)為11.8。L-SHK對(duì)HeLa/DDP細(xì)胞的抑制率有隨劑量增加而逐漸升高的趨勢(shì)。與單用DDP比較，DDP+低、中、高劑量L-SHK組細(xì)胞的IC50值均顯著降低，且呈劑量依賴性（P<0.05）;DDP+低、中、高劑量L-SHK組的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為1.38、2.80、6.71。與空白對(duì)照組比較，各藥物組G0/G1期、S期細(xì)胞比例，各劑量L-SHK聯(lián)用組細(xì)胞的早期、晚期凋亡率及總凋亡率以及Bax、Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)量均顯著升高;各藥物組G2/M期細(xì)胞比例以及各劑量L-SHK聯(lián)用組Bcl-2蛋白的表達(dá)量均顯著降低（P<0.05）。與DDP組比較，各劑量L-SHK聯(lián)用組S期、G2/M期細(xì)胞比例和Bcl-2蛋白的表達(dá)量均顯著降低;G0/G1期細(xì)胞比例，早期、晚期凋亡率及總凋亡率和Bax、Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)量均顯著升高（P<0.05）。結(jié)論：HeLa/DDP細(xì)胞對(duì)DDP具有一定的耐藥性，L-SHK可逆轉(zhuǎn)這種耐藥性。L-SHK和DDP聯(lián)用可促進(jìn)HeLa/DDP細(xì)胞凋亡，且作用強(qiáng)于DDP單用;這種作用可能與影響細(xì)胞周期、調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 人宮頸癌HeLa細(xì)胞;左旋紫草素;順鉑;耐藥;凋亡;細(xì)胞周期;凋亡蛋白;逆轉(zhuǎn)作用;機(jī)制

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the reversal effects and potential mechanism of levoshikonin（L-SHK）on cisplatin（DDP） resistance of human cervical carcinoma HeLa cells. METHODS： Human cervical carcinoma HeLa cells were used as research objects， and drug-resistant HeLa/DDP cells were induced by DDP. CCK-8 assay was used to determine drug resistance index of HeLa/DDP cells， the inhibition rate of different doses of L-SHK （0.125， 0.25， 0.5， 1， 2， 4， 8， 16 μmol/L） on cell proliferation， IC50 and the reversion index of L-SHK on HeLa/DDP cells. Effects of low， medium and high doses of L-SHK （0.3， 0.6， 1.2 μmol/L） combined with DDP on cell cycle and apoptosis rate were determined by flow cytometry. Western blotting assay was used to detect the effects of low， medium and high doses of L-SHK （0.3， 0.6， 1.2 μmol/L） combined with DDP on the expression of apoptosis-related protein （Cleaved caspase-3， Bcl-2 and Bax）. RESULTS： The drug resistance index of HeLa/DDP cells was 11.8. The inhibition rate of L-SHK on HeLa/DDP cells increased with the increase of dose. Compared with DDP alone， IC50 of DDP+low-dose， medium-dose and high-dose L-SHK groups were decreased significantly， with a dose-dependent manner （P<0.05）. The reversion indexes were 1.38， 2.80， 6.71 in DDP+low-dose， medium-dose and high-dose L-SHK groups. Compared with blank control group， the proportion of cells at phase G0/G1 and phase S in administration groups， as well as early and late apoptosis rate and total apoptosis rate of cells， the protein expression of Bax and Cleaved caspase-3 in L-SHK combination groups were increased significantly; the proportion of cells at phase G2/M in administration group as well as the protein expression of Bcl-2 in L-SHK combination groups were decreased significantly （P<0.05）. Compared with DDP group， the proportion of cells at phase S and G2/M and the protein expression of Bcl-2 in L-SHK combination groups were significantly decreased; the proportion of cells at phase G0/G1， early and late apoptosis rate and total apoptosis rate， the protein expression of Bax and Cleaved caspase-3 in L-SHK combination groups were significantly increased （P<0.05）. CONCLUSIONS： HeLa/DDP cells are resistant to DDP， and L-SHK can reverse the drug resistance. L-SHK combined with DDP can promote the apoptosis of HeLa/DDP cells， which is better than DDP alone. Its mechanism may be related to the influence of cell cycle and the regulation of apoptosis-related protein expression.

KEYWORDS? ?Human cervical carcinoma HeLa cells; Levoshikonin; Cisplatin; Resistance; Apoptosis; Cell cycle; Apoptosis- related protein; Reversal effect; Mechanism

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤，發(fā)病率在全球女性常見惡性腫瘤中位居第3位，最新的統(tǒng)計(jì)顯示，全球每年新發(fā)宮頸癌56.9萬(wàn)例，死亡約31.1萬(wàn)例[1-2]。化療是當(dāng)前治療宮頸癌的主要手段，順鉑（Cisplatin，以下簡(jiǎn)稱“DDP”）為宮頸癌化療的一線用藥。然而，由于DDP長(zhǎng)期應(yīng)用易導(dǎo)致耐藥的發(fā)生，嚴(yán)重影響了宮頸癌的治療效果[3]。由此可見，DDP耐藥性問題是宮頸癌臨床治療中亟待解決的難題之一。紫草（Arnebiae Radix）為紫草科多年生草本植物新疆紫草[Arnebia ecuchroma （Royle） Johnst.]或內(nèi)蒙紫草（Arnebia guttata Bunge）的干燥根，具有涼血、活血、解毒、透疹的功效，常用于治療血熱毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、瘡瘍、濕疹、水火燙傷等癥[4]。紫草素（Shikonin，以下簡(jiǎn)稱“SHK”）是從紫草中分離得到的一種天然萘醌類化合物。有研究證明，該化合物可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，并可通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和壞死等途徑來(lái)發(fā)揮對(duì)腫瘤的治療作用[5-6]。目前有新的研究表明，SHK對(duì)部分耐藥腫瘤細(xì)胞具有一定的逆轉(zhuǎn)作用，在耐藥性卵巢癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、肺癌等的治療方面表現(xiàn)突出[7-14]。天然提取的SHK包含左旋體和右旋體兩種旋光異構(gòu)體，由于其右旋體不溶于水，故多以左旋紫草素（L-SHK）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。本課題組前期研究顯示，L-SHK聯(lián)合DDP能夠增強(qiáng)DDP對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的抑制作用[15]?；诖?，本研究擬進(jìn)一步研究L-SHK對(duì)DDP耐藥宮頸癌細(xì)胞（HeLa/DDP）耐藥性的影響及其可能的分子機(jī)制，以期為耐藥逆轉(zhuǎn)劑的篩選以及SHK類化合物新藥的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

31型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）;Eclipse TS100型顯微鏡、GPJ9-TS100-F型倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）;Epoch 2型微孔板分光光度計(jì)（美國(guó)BioTek公司）;FACSCanto Ⅱ型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）;PowerPac型細(xì)胞電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）;C-DIGIT凝膠成像儀（美國(guó)LI-COR公司）;MH1型微量振蕩儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）;DK-8D型水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;PMC-060型迷你掌上離心機(jī)（日本Tomy公司）;AC2-6S1AirstreamⅡ級(jí)A2型生物安全柜（美國(guó)SCCO公司）;AB 135-S型十萬(wàn)分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

L-SHK對(duì)照品（天津一方科技有限公司，批號(hào)：AB072S，純度：>99%）;DDP注射液（江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：601191902，規(guī)格：6 mL ∶ 30 mg）;RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)分別為1181753、C2027005）;含乙二胺四乙酸（EDTA）的0.25%胰酶（天津百諾克醫(yī)藥生物技術(shù)科技有限公司，批號(hào)：280514）;不含ETDA的胰酶（美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)：1715826）;膜聯(lián)蛋白Ⅴ-硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin Ⅴ-FITC/PI）凋亡檢測(cè)試劑盒、RNA酶A（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)分別為C0080、R10030）;CCK-8檢測(cè)試劑（日本Dojindo公司，批號(hào)：KN709）;RIPA細(xì)胞裂解液（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：C0157）;兔抗人Bax、Bcl-2、剪切型胱天蛋白酶3（Cleaved caspase-3）、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體（美國(guó)ImmunoWay Biotechnology公司，批號(hào)分別為YM2631、YT0278、YC0002、YM2018）;蛋白上樣緩沖液、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G抗體（碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：P0013、A0217）;DC蛋白定量試劑盒（美國(guó)Bio-Rad公司，批號(hào)1702409）;Western blotting試驗(yàn)顯影液、定影液（天津開發(fā)區(qū)宏豐科工貿(mào)有限公司）;ECl發(fā)光液由本實(shí)驗(yàn)室自制;二甲基亞砜（DMSO）等試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細(xì)胞

人宮頸癌HeLa細(xì)胞系由天津市腫瘤醫(yī)院公共實(shí)驗(yàn)室提供。

2 方法

2.1 溶液的配制

稱取L-SHK對(duì)照品10 mg，溶于DMSO 1 mL中，制成濃度為34.7 μmol/L的L-SHK貯備液，置于4 ℃冰箱中保存;以DDP注射液作為DDP貯備液（5 g/L），于4 ℃冰箱中冷藏保存。

2.2 HeLa細(xì)胞及HeLa/DDP細(xì)胞的培養(yǎng)

2.2.1 HeLa細(xì)胞 取出凍存的HeLa細(xì)胞，在37 ℃水浴中迅速融化，以1 000 r/min離心5 min，沉淀加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液（以下簡(jiǎn)稱“完全培養(yǎng)基”）1 mL，吹打均勻后接種至培養(yǎng)皿中，于37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)（培養(yǎng)條件下同）。觀察細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿的80%時(shí)傳代1次，具體操作如下：吸棄培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.5）清洗1～2次，加入含EDTA的0.25%胰酶、PBS各1 mL，消化2～3 min，加入不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液終止消化，吹打制成細(xì)胞懸液，再按細(xì)胞懸液與培養(yǎng)液體積比1 ∶ 3進(jìn)行傳代，培養(yǎng)，即得HeLa細(xì)胞。

2.2.2 HeLa/DDP細(xì)胞 取出凍存的HeLa細(xì)胞按照“2.2.1”項(xiàng)下方法復(fù)蘇后，加入完全培養(yǎng)基1 mL，培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿的80%后按“2.2.1”項(xiàng)下方法傳代，待傳代細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將培養(yǎng)基更換為含DDP 100 μg/L的RPMI 1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，棄去原培養(yǎng)液，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿的80%后同法傳代，待傳代細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)加入DDP（質(zhì)量濃度為前次培養(yǎng)的2倍），反復(fù)換藥培養(yǎng)，直至DDP質(zhì)量濃度達(dá)100 mg/L（根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果確定），即得HeLa/DDP細(xì)胞。

2.3 HeLa/DDP細(xì)胞耐藥指數(shù)的檢測(cè)

采用CCK-8法檢測(cè)。取“2.2”項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa和HeLa/DDP細(xì)胞適量，以5 000個(gè)/孔接種至96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組（即DDP組）和不同劑量藥物組。對(duì)照組加入完全培養(yǎng)基100? ? ?μL，各藥物組加入含DDP的完全培養(yǎng)基100 μL（DDP的最終質(zhì)量濃度分別為0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 mg/L，劑量設(shè)置參考前期預(yù)試驗(yàn)所得DDP對(duì)非耐藥細(xì)胞的作用濃度[9]），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入CCK-8試劑10 μL;培養(yǎng)2.5 h后，使用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度（OD）值，在計(jì)算抑制率、半數(shù)抑制濃度（IC50）的基礎(chǔ)上，計(jì)算HeLa/DDP細(xì)胞的耐藥指數(shù)。抑制率=（1-試驗(yàn)組細(xì)胞OD值/對(duì)照組細(xì)胞OD值）×100%;耐藥指數(shù)=藥物對(duì)耐藥細(xì)胞的IC50/藥物對(duì)敏感細(xì)胞的IC50（當(dāng)耐藥指數(shù)<5時(shí)，為低度耐藥;當(dāng)耐藥指數(shù)為5～15時(shí)，為中度耐藥;當(dāng)耐藥指數(shù)>15時(shí)，為高度耐藥[16]）。上述試驗(yàn)重復(fù)3次（下同）。

2.4 L-SHK對(duì)HeLa/DDP的增殖抑制作用及耐藥逆轉(zhuǎn)作用考察

2.4.1 L-SHK對(duì)HeLa/DDP的增殖抑制作用 采用CCK-8法檢測(cè)。取“2.2”項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa/DDP細(xì)胞適量，以5 000個(gè)/孔接種至96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組（即DDP組）和不同劑量藥物組。對(duì)照組加入含DDP的完全培養(yǎng)基100 μL（DDP的最終質(zhì)量濃度為2 mg/L，劑量設(shè)置參考該藥表觀分布容積及“2.3”項(xiàng)下試驗(yàn)結(jié)果，下同），各藥物組加入同時(shí)含L-SHK和DDP的完全培養(yǎng)基100 μL（DDP最終質(zhì)量濃度均為2 mg/L，L-SHK的最終濃度分別為0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16 μmol/L;劑量設(shè)置參考前期預(yù)試驗(yàn)所得L-SHK對(duì)非耐藥細(xì)胞的作用濃度[9]），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入CCK-8試劑10 μL;培養(yǎng)2.5 h后，使用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的OD值，按“2.3”項(xiàng)下方法計(jì)算抑制率。

2.4.2 L-SHK對(duì)HeLa/DDP的耐藥逆轉(zhuǎn)作用 采用CCK-8法測(cè)定。取“2.2”項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa/DDP細(xì)胞適量，以5 000個(gè)/孔接種至96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組（即DDP組）和不同劑量藥物組。對(duì)照組加入含DDP的完全培養(yǎng)基100 μL（DDP的最終質(zhì)量濃度為2 mg/L），各藥物組分別加入同時(shí)含DDP和L-SHK的完全培養(yǎng)基100 μL（DDP的最終質(zhì)量濃度均為2 mg/L，低、中、高劑量L-SHK的最終濃度分別為0.3、0.6、1.2 μmol/L;劑量設(shè)置參考“2.4.1”項(xiàng)下結(jié)果及前期試驗(yàn)結(jié)果[15]，下同），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入CCK-8試劑10 μL;培養(yǎng)2.5 h后，使用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的OD值，按“2.3”項(xiàng)下方法計(jì)算抑制率和IC50，并計(jì)算逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=使用逆轉(zhuǎn)劑前藥物對(duì)細(xì)胞的IC50/使用逆轉(zhuǎn)劑后藥物對(duì)細(xì)胞的IC50。

2.5 L-SHK聯(lián)合DDP對(duì)HeLa/DDP細(xì)胞周期分布的影響考察

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。取“2.2”項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa/DDP細(xì)胞適量，以5 000個(gè)/孔接種于24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、DDP組以及DDP+低、中、高劑量L-SHK組?？瞻讓?duì)照組加入完全培養(yǎng)基1 mL，各給藥組加入含相應(yīng)藥物的完全培養(yǎng)基1 mL（DDP最終質(zhì)量濃度均為2 mg/L，低、中、高劑量L-SHK的最終濃度分別為0.3、0.6、1.2 μmol/L），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，用4 ℃的PBS清洗2次后，置于4 ℃的70%乙醇中固定過夜;以1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，用預(yù)冷的PBS清洗2次，棄去上清液;每管加入PI試劑500 μL，同時(shí)加入RNA酶A使其最終質(zhì)量濃度達(dá)100 μg/mL，于4 ℃染色15 min后，使用流式細(xì)胞儀測(cè)定各細(xì)胞周期的分布比例。

2.6 L-SHK聯(lián)合DDP對(duì)HeLa/DDP細(xì)胞凋亡的影響考察

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。取“2.2”項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa/DDP細(xì)胞適量，以5 000個(gè)/孔接種于12孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，按“2.5”項(xiàng)下方法分組、給藥，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，用不含EDTA的胰酶消化，以? ? ?1 000 r/min離心5 min后，棄去上清液，以PBS洗滌2次，收集細(xì)胞。每組細(xì)胞分別加入Annexin Ⅴ-FITC結(jié)合液195 μL，輕輕重懸;再于暗室內(nèi)加入Annexin Ⅴ-FITC染色液5 μL，輕輕混勻;最后加入PI試劑5 μL，混勻，于室溫避光孵育10 min后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其早期、晚期凋亡率及總凋亡率。

2.7 L-SHK聯(lián)合DDP對(duì)HeLa/DDP細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響考察

采用Western blotting法檢測(cè)。取“2.2”項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa/DDP細(xì)胞適量，以5 000個(gè)/孔接種于12孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，按“2.5”項(xiàng)下方法分組、給藥，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，加入RIPA細(xì)胞裂解液100 μL，充分混勻，冰浴30 min，于4 ℃下以12 000 r/min離心20 min，收集上清液，以DC法測(cè)定蛋白含量。蛋白經(jīng)上樣緩沖液稀釋后，于100 ℃下變性5 min。取變性后的蛋白樣品適量，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（電壓：80～180 V）;電泳后，于80 V下轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上;以5%脫脂奶粉封閉1 h后，分別加入相應(yīng)一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過夜;用三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（TBST）溶液清洗5 min×3次，加入相應(yīng)二抗（稀釋度為1 ∶ 5 000），室溫孵育1 h;用TBST溶液清洗5 min×3次，以ECL發(fā)光液顯色處理后，置于凝膠成像儀上成像并采用Image J v1.7.0軟件分析，以相應(yīng)蛋白與內(nèi)參β-actin的灰度值比值表示該蛋白的表達(dá)量。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 15.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 HeLa/DDP耐藥細(xì)胞的耐藥指數(shù)

DDP對(duì)HeLa/DDP細(xì)胞的IC50值為（35.82±0.34）mg/L，顯著高于其對(duì)HeLa細(xì)胞的（3.04±0.43） mg/L（P<0.05）;HeLa/DDP細(xì)胞的耐藥指數(shù)為11.8，為中度耐藥。

3.2 L-SHK對(duì)HeLa/DDP細(xì)胞的抑制及耐藥逆轉(zhuǎn)作用

3.2.1 L-SHK對(duì)HeLa/DDP細(xì)胞的抑制作用 L-SHK作用后HeLa/DDP細(xì)胞的抑制率見圖1。由圖1可見，L-SHK對(duì)HeLa/DDP細(xì)胞的抑制率有隨劑量增加而逐漸升高的趨勢(shì)，其IC50為3.92 μmol/L。結(jié)合上述結(jié)果并參考本課題組前期試驗(yàn)結(jié)果[15]，發(fā)現(xiàn)當(dāng)L-SHK為0.3、0.6、1.2 μmol/L時(shí)，其對(duì)HeLa/DDP細(xì)胞的抑制作用較小，故以這3個(gè)濃度分別作為后續(xù)試驗(yàn)的低、中、高劑量。

3.2.2 L-SHK對(duì)HeLa/DDP細(xì)胞的耐藥逆轉(zhuǎn)作用 L- SHK作用后HeLa/DDP細(xì)胞的IC50和逆轉(zhuǎn)指數(shù)見表1。由表1可見，與DDP組比較，DDP+低、中、高劑量L-SHK組的IC50值均顯著降低，且DDP+中、高劑量L-SHK組顯著低于DDP+低劑量L-SHK組，DDP+高劑量L-SHK組顯著低于DDP+中劑量L-SHK組（P<0.05），呈劑量依賴性;DDP+低、中、高劑量L-SHK組的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為1.38、2.80、6.71。

3.3 L-SHK聯(lián)合DDP對(duì)HeLa/DDP細(xì)胞周期的影響

與空白對(duì)照組比較，各藥物組G0/G1期、S期細(xì)胞比例均顯著升高，G2/M期細(xì)胞比例均顯著降低（P<0.05）;與DDP組比較，DDP+低、中、高劑量L-SHK組G0/G1期細(xì)胞比例均顯著升高，S期、G2/M期細(xì)胞比例均顯著降低（P<0.05），詳見圖2、表2。

3.4 L-SHK聯(lián)合DDP對(duì)HeLa/DDP細(xì)胞凋亡的影響

與空白對(duì)照組和DDP組比較，DDP+低、中、高劑量L-SHK組細(xì)胞的早期、晚期凋亡率及總凋亡率均顯著升高（P<0.05）;而DDP組上述指標(biāo)與空白對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見圖3、表3。

3.5 L-SHK聯(lián)合DDP對(duì)HeLa/DDP細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組和DDP組比較，DDP+L-SHK聯(lián)用組細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)量均顯著降低，Bax、Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)量均顯著升高（P<0.05）;而DDP上述指標(biāo)與空白對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見圖4、表4。

4 討論

近年來(lái)，有關(guān)SHK類化合物的研究報(bào)道日益增多，其作為腫瘤耐藥治療的增敏劑，可一定程度上逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性[9-12]，這一發(fā)現(xiàn)使得腫瘤治療領(lǐng)域的研究有了新的突破。Shilnikova K等[7]研究了L-SHK對(duì)DDP耐藥的人卵巢癌A2780細(xì)胞（A2780-CR）的毒性和遷移抑制作用，發(fā)現(xiàn)該化合物可增加耐藥細(xì)胞線粒體膜去極化、上調(diào)上皮細(xì)胞鈣黏蛋白表達(dá)、下調(diào)神經(jīng)元鈣黏蛋白表達(dá)，從而降低A2780-CR細(xì)胞的遷移能力，抑制該細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。替莫唑胺（TMZ）是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）常用的化療藥物，但其嚴(yán)重的耐藥性影響了GBM的治療效果;將SHK、TMZ聯(lián)合處理GBM細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)GBM細(xì)胞的增殖和遷移能力均有所減弱，基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9的表達(dá)均明顯下調(diào)，并可通過抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號(hào)通路來(lái)減少GBM的復(fù)發(fā)[8]。Wang Y等[11]在研究SHK抗膀胱癌的作用機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，與DDP單用相比，SHK與DDP聯(lián)用對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果更顯著，作用機(jī)制可能與SHK可逆轉(zhuǎn)膀胱癌細(xì)胞的DDP耐藥有關(guān)。有研究顯示，L-SHK可提高EGFR基因野生型非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者應(yīng)用厄洛替尼/吉非替尼的抗癌效果，且聯(lián)用效果優(yōu)于任一藥物單用，其機(jī)制可能為通過激活活性氧（ROS）介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[17]。

基于上述文獻(xiàn)和本課題前期工作，本研究首先建立了DDP耐藥HeLa細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)DDP對(duì)HeLa/DDP細(xì)胞的IC50值為（35.82±0.34） mg/L，顯著高于其對(duì)HeLa細(xì)胞的（3.04±0.43） mg/L;其耐藥指數(shù)為11.8，提示該細(xì)胞耐藥性為中等。本研究進(jìn)一步探討了不同劑量L-SHK對(duì)HeLa/DDP細(xì)胞增殖的抑制和耐藥逆轉(zhuǎn)作用。結(jié)果顯示，不同劑量L-SHK對(duì)HeLa/DDP細(xì)胞的抑制作用有隨劑量增加而逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì);與DDP單用相比，聯(lián)用低、中、高劑量L-SHK后，其對(duì)HeLa/DDP細(xì)胞的IC50值均顯著降低，且具有劑量依賴性;其逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為1.38、2.80、6.71，提示L-SHK具有一定的耐藥逆轉(zhuǎn)活性。

前期研究結(jié)果顯示，L-SHK與DDP聯(lián)用可明顯抑制HeLa細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步探討了L-SHK與DDP聯(lián)用對(duì)HeLa/DDP細(xì)胞周期及凋亡情況的影響。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，各藥物組G0/G1期、S期細(xì)胞比例以及各劑量L-SHK聯(lián)用組細(xì)胞早期、晚期凋亡率及總凋亡率均顯著升高，各藥物組G2/M期細(xì)胞比例均顯著降低;且各劑量L-SHK聯(lián)用組G0/G1期細(xì)胞比例以及早期、晚期凋亡率及總凋亡率均顯著高于DDP組，S期、G2/M期細(xì)胞比例均顯著低于DDP組。這提示與單用DDP比較，聯(lián)用L-SHK可抑制細(xì)胞周期由G0/G1期向S期、G2/M期的轉(zhuǎn)換，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

為進(jìn)一步研究L-SHK促進(jìn)HeLa/DDP細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制，本研究采用Western blotting法檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。促進(jìn)細(xì)胞凋亡是抗腫瘤藥物發(fā)揮治療效果的重要途徑之一，且在凋亡過程中均伴有Caspase-3家族的激活;該家族激活后，Caspase-3轉(zhuǎn)變?yōu)镃leaved caspase-3，后者表達(dá)越多，則表明細(xì)胞凋亡比例越高[18]。Bcl-2和Bax是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，其中Bcl-2發(fā)揮抗凋亡作用，而Bax發(fā)揮促凋亡作用[19]。本研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和DDP組比較，各劑量L-SHK聯(lián)用組細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)量均顯著降低，Bax、Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)量均顯著升高。這提示L-SHK可通過上調(diào)Bax、Cleaved caspase-3蛋白和下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)來(lái)促進(jìn)耐藥細(xì)胞HeLa/DDP的凋亡，且這種作用強(qiáng)于DDP單用，與許靜等[20]的研究結(jié)果基本一致。

綜上所述，L-SHK聯(lián)合DDP可逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞HeLa/DDP的耐藥性，其作用可能是通過影響細(xì)胞周期、調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。但本研究并未對(duì)具體的作用機(jī)制以及其他相關(guān)因子（如P-糖蛋白、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白1、M2型丙酮酸激酶等）進(jìn)行探討，故有待后續(xù)研究進(jìn)一步完善。

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（收稿日期：2020-01-07 修回日期：2020-05-11）

（編輯：張?jiān)拢?/p>