基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選山羊卵泡發(fā)育相關(guān)上調(diào)基因

孟金柱，安清明，趙成剛，趙園園

（銅仁學(xué)院農(nóng)林工程與規(guī)劃學(xué)院，貴州銅仁 554300）

哺乳動(dòng)物的卵泡是生殖系統(tǒng)的重要組成部分，它在控制發(fā)情周期、發(fā)情行為，確保卵母細(xì)胞能力及后期胚胎存活率、排卵后黃體功能和孕酮合成[1-3]等方面起著重要作用。卵泡顆粒細(xì)胞可以特異表達(dá)17β-羥基類固醇脫氫酶受體，細(xì)胞色素P450芳構(gòu)化酶受體和FSH等各種激素受體，并且將膜細(xì)胞分泌的雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素（E2）分泌到卵泡液并輸送到血液中，在卵泡的發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用[4]。

綿羊[5]、奶牛[6]和豬[7]等多種動(dòng)物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制已經(jīng)通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序被發(fā)現(xiàn)。對(duì)水牛不同大小的卵泡顆粒細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)可能會(huì)參與卵泡的成熟和排卵，例如細(xì)胞毒性受到自然殺傷細(xì)胞的介導(dǎo)、同種異體排斥反應(yīng)、抗原處理和呈遞、趨化因子信號(hào)通路等[8]。本研究旨在通過對(duì)貴州白山羊優(yōu)勢(shì)卵泡和從屬卵泡中的顆粒細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選出卵泡發(fā)育上調(diào)相關(guān)基因，對(duì)篩選促進(jìn)山羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖、調(diào)控E2分泌的關(guān)鍵因子以及探討調(diào)控優(yōu)勢(shì)卵泡被選擇的潛在機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集 選取10只1歲齡健康的貴州白山羊，分別注射前列腺素2α（PGF2α）使其同期發(fā)情，同時(shí)每天使用B超儀檢測(cè)卵泡直徑大小，直到發(fā)情出現(xiàn)3 d后，從中挑選3只卵巢卵泡發(fā)育較好的山羊屠宰并采集優(yōu)勢(shì)卵泡（DF，直徑4.5～6 mm）與從屬卵泡（SF，直徑3～4.5 mm）。用1 mL注射器分別抽取DF和SF中的卵泡液后，剪開卵泡壁，刮取顆粒細(xì)胞（GCs）。

1.2 總RNA提取、文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序 用Trizol法分別提取3只山羊DF及SF顆粒細(xì)胞中的總RNA，用RNeasy mini kit （Qiagen）純化，Agilent Bioanalyzer 2100檢測(cè)完整性，Qubit 2.0 Flurometer測(cè)量濃度后，交由北京諾和致源生物信息科技有限公司進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建、Illumina Hiseq 2500平臺(tái)測(cè)序，獲得原始reads。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析 通過FastQC （http://www.bioinfor matics.babraha m.ac.uk/projects/fastqc/）將獲得的原始reads過濾后獲得高品質(zhì)的干凈reads。采用Trinity（http://trinityrnaseq.sourceforge.net/）將干凈reads從頭組裝得到unigenes序列。應(yīng)用SOAP V2.0平臺(tái)將獲得的unigenes比對(duì)到山羊的RefSeq （ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/001/704/415/GCF_001704415.1_ARS1/）數(shù)據(jù)庫(kù)中，獲得mRNA。使用DESeq2軟件對(duì)獲得的mRNA進(jìn)行差異表達(dá)分析并篩選出上調(diào)表達(dá)基因。使用DAVID軟件對(duì)得到的上調(diào)表達(dá)基因進(jìn)行GO分析及KEGG信號(hào)通路分析。

1.4 反轉(zhuǎn)錄及引物合成 將轉(zhuǎn)錄組測(cè)序留存的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件參照產(chǎn)品（北京全式金）說明書進(jìn)行：42℃孵育15 min，85℃加熱5 s，用Primer 5.0設(shè)計(jì)具有代表性的4個(gè)上調(diào)表達(dá)基因的引物（表1），并使用β-actin作為內(nèi)參基因，交由北京華大基因有限公司合成。

表1 供試引物序列

1.5 熒光定量PCR鑒定 Real-time PCR用于鑒定轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中貴州白山羊DF與SF顆粒細(xì)胞中差異表達(dá)上調(diào)mRNA的相對(duì)表達(dá)量。設(shè)置5個(gè)樣本重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)，根據(jù)產(chǎn)品說明書構(gòu)建20 μL PCR反應(yīng)體系：模板cDNA 4 μL，上下游引物各0.5 μL，SYBR MIX 10 μL，H2O 5 μL，PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性1 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 各基因在DF和SF顆粒細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量采用2－ΔΔCT來計(jì)算，并經(jīng)β-actin校正后，采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤來表示，應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 貴州白山羊卵泡顆粒細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)基因的篩選 將測(cè)序結(jié)果比對(duì)到山羊的RefSeq數(shù)據(jù)庫(kù)后得到33 896個(gè)基因，其中FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped）≥1的基因有13 644個(gè)。使用DESeq2軟件對(duì)這13 644個(gè)基因進(jìn)行差異表達(dá)分析，設(shè)置參數(shù)：log2（DF FPKM/SF FPKM）＞0.5，P＜0.05，共獲得695個(gè)差異表達(dá)基因，其中233個(gè)表達(dá)顯著上調(diào)基因，聚類分析熱圖表明樣本之間的差異表達(dá)基因重復(fù)性較好（圖1），表2中列出了差異表達(dá)倍數(shù)最高的10個(gè)上調(diào)基因及其功能。

表2 貴州白山羊DF和SF中上調(diào)基因及其功能分析

2.2 山羊卵泡顆粒細(xì)胞中上調(diào)基因GO功能富集 通過對(duì)233個(gè)表達(dá)顯著上調(diào)mRNA進(jìn)行GO功能富集分析，共分為三大類別44組：參與生物學(xué)過程（BP）的基因占72.7%，其中參與RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控過程的基因數(shù)達(dá)16個(gè)；參與細(xì)胞組分（CC）的基因占13.6%，其中參與原子核相關(guān)功能組分的基因有38個(gè)；參與分子功能的基因占13.6%，其中與ATP結(jié)合功能相關(guān)的基因有24個(gè)（圖2）。

2.3 山羊卵泡顆粒細(xì)胞中上調(diào)基因KEGG信號(hào)通路分析為進(jìn)一步獲得與促進(jìn)山羊卵泡發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路，通過kobas軟件對(duì)上調(diào)表達(dá)基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析，共發(fā)現(xiàn)20條通路（圖3），在這些通路中，富集最為顯著的是核糖體通路。

2.4 山羊卵泡顆粒細(xì)胞中上調(diào)基因驗(yàn)證結(jié)果分析 通過功能分析，最終從上調(diào)表達(dá)基因中篩選出4個(gè)具有代表性的在山羊卵泡發(fā)育過程中可能會(huì)起正調(diào)控作用的基因（表3）。相對(duì)熒光定量結(jié)果顯示，CALM2、TUT7和PDLIM3在DF和SF中的表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致，且TUT7和CALM2在DF顆粒細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于SF（圖4）。

3 討論

表3 抑制貴州白山羊卵泡發(fā)育的候選基因

哺乳動(dòng)物在發(fā)育過程中，卵巢上最大的卵泡即未來的優(yōu)勢(shì)卵泡持續(xù)生長(zhǎng)、成熟并排出卵子[9-10]。有腔卵泡的生長(zhǎng)表現(xiàn)為通過在時(shí)間和空間上的有序組織來促進(jìn)對(duì)促性腺激素的響應(yīng)，這首先導(dǎo)致卵泡募集，并伴隨著卵泡波的出現(xiàn)，然后促進(jìn)優(yōu)勢(shì)卵泡生長(zhǎng)成為排卵卵泡[11-12]。本研究通過對(duì)貴州白山羊DF和SF顆粒細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選出233個(gè)上調(diào)表達(dá)基因。其他研究者也在不同物種中發(fā)現(xiàn)卵泡發(fā)育相關(guān)基因，如陸婷婷等[13]對(duì)川中黑山羊大、小卵泡進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)403個(gè)差異表達(dá)的基因，其中，顯著上調(diào)的有281個(gè)，顯著下調(diào)的有122個(gè)。郝慶玲[14]對(duì)牛（發(fā)生偏差前的第一大卵泡）PDF1和（發(fā)生偏差前的第二大卵泡）PDF2的研究發(fā)現(xiàn)608個(gè)差異表達(dá)的基因，并從中找出11個(gè)與卵泡發(fā)育密切相關(guān)的基因。沈曼曼[15]研究蛋雞卵泡發(fā)育，發(fā)現(xiàn)在小黃卵泡和F6卵泡中差異表達(dá)的基因有1 380個(gè)，其中，上調(diào)基因490個(gè)，下調(diào)基因890個(gè)。

本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)上調(diào)表達(dá)基因進(jìn)行GO、KEGG分析，共篩選出4個(gè)具有代表性的基因，可能會(huì)促進(jìn)卵泡的發(fā)育，熒光定量結(jié)果顯示，CALM2、TUT7和PDLIM3在DF和SF中的表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致，且TUT7和CALM2在DF顆粒細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于SF。

在小鼠的研究中，TUT7通過介導(dǎo)mRNA的3' 端尿苷化，來消除卵母細(xì)胞生長(zhǎng)過程中的轉(zhuǎn)錄本，對(duì)卵母細(xì)胞成熟和生育能力都至關(guān)重要[16]。在斑馬魚[17]和非洲爪蟾[18]的研究中發(fā)現(xiàn)，阻止TUT7的翻譯會(huì)導(dǎo)致原腸胚在形成過程中發(fā)生缺陷，尿苷缺陷型的胚胎不能逐步淘汰壞死的轉(zhuǎn)錄本，導(dǎo)致后期合子不能正常轉(zhuǎn)錄，而尿苷化會(huì)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄組重編程，進(jìn)而驅(qū)動(dòng)早期胚胎的發(fā)育轉(zhuǎn)變。鈣調(diào)蛋白（CALM）是一種普遍存在的Ca2+結(jié)合蛋白，調(diào)節(jié)大量Ca2+敏感的生物事件，包括Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[19-20]。轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)證明，過表達(dá)細(xì)胞核Ca2+-CaM依賴激酶II（CaMKII），心臟肥大發(fā)病率顯著增加[21]。抑制細(xì)胞核內(nèi)CAMKII的活性使得轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟比非轉(zhuǎn)基因小鼠小[22]。此外，CAMKII還參與了細(xì)胞凋亡信號(hào)的傳遞，CAMKII選擇性抑制劑可顯著抑制細(xì)胞凋亡[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，TUT7、CALM在卵泡DF顆粒細(xì)胞中的含量顯著高于SF中，推測(cè)其在山羊卵泡發(fā)育過程中可能促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)，進(jìn)而會(huì)導(dǎo)致卵泡的優(yōu)勢(shì)化。關(guān)于PDLIM3和LUM在卵泡中的研究尚未見報(bào)道，本研究結(jié)果顯示，PDLIM3在貴州白山羊DF顆粒細(xì)胞中的表達(dá)量高于SF中，但差異不顯著，暗示其可能不是促進(jìn)卵泡成為優(yōu)勢(shì)卵泡的關(guān)鍵調(diào)控因子。

4 結(jié)論

本研究在貴州白山羊DF與SF中的顆粒細(xì)胞獲得233個(gè)上調(diào)表達(dá)mRNA。通過功能分析，篩選出2個(gè)可能與山羊卵泡發(fā)育相關(guān)的上調(diào)表達(dá)基因，并進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，TUT7和CALM2在DF顆粒細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于在SF顆粒細(xì)胞中的表達(dá)量，推測(cè)這些基因在山羊卵泡發(fā)育過程中可能會(huì)促進(jìn)卵泡的發(fā)育，最終導(dǎo)致優(yōu)勢(shì)卵泡被選擇。