黑羽番鴨CAPN1 基因的克隆及生物信息學分析

李 浩，胡志剛，陳 強，張慧林，劉小林*

（1.西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西楊陵 712100；2.陜西省潼關安大番鴨育種場，陜西潼關 714300）

番鴨具有生長速度快、瘦肉率高等眾多優(yōu)良品質(zhì)，是十分優(yōu)秀的肉鴨育種素材[1-2]，但其肉質(zhì)極其粗糙，因此番鴨育種的目標是盡可能地改善肌肉嫩度。肉質(zhì)嫩化受多種因素影響，是一個十分復雜的過程，其中關鍵肌原纖維蛋白的降解和肌纖維類型的轉(zhuǎn)化發(fā)揮著舉足輕重的作用[3-5]。CAPNs（鈣蛋白酶，Calpains）是一個細胞內(nèi)鈣離子依賴性半胱氨酸蛋白酶家族，CAPN1（鈣蛋白酶1，Calpains 1）是該家族的重要成員之一[6-7]。大量研究表明CAPN1基因在肌肉嫩化過程中發(fā)揮著關鍵作用[6-11]。此外，有研究表明CAPN1基因的多態(tài)性與肌內(nèi)脂肪含量密切相關[8-9]。Cafe等[10]證明了牛CAPN1基因的多態(tài)性與肌肉嫩度密切相關。Kubota等[11]研究發(fā)現(xiàn)CAPN1基因與家雞的體重、肌纖維直徑、嘌呤含量等顯著相關。綜上，CAPN1基因在肌肉發(fā)育、嫩度調(diào)控以及肉的風味改善中發(fā)揮著重要作用，但國內(nèi)外尚沒有關于CAPN1基因在番鴨中的研究。本實驗以黑羽番鴨為研究對象，對其CAPN1基因的編碼區(qū)序列進行克隆；之后采用生物信息學方法進行同源性和系統(tǒng)進化分析，并對其蛋白的理化性質(zhì)、親疏水性、信號肽剪切位點、跨膜區(qū)、亞細胞定位、結構域、修飾位點及空間結構等進行預測，以期為進一步研究CAPN1基因功能和選育黑羽番鴨新品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗動物：本實驗所用黑羽番鴨（黑番鴨）來自陜西潼關安大番鴨育種廠，選取1周齡黑番鴨，取指甲蓋大小的腿肌。采集的組織樣品在液氮中速凍，之后保存于-80℃冰箱中備用。

實驗試劑：DEPC水（Biotopped，China），75%乙醇（用RNase-free ddH2O配置），inNova Uscript II First-Strand cDNA Synthesis SuperMix （AR121，innova gene），Q5 High-Fidelity DNA聚合酶（M0491，NEB），pMD18-T Vector Cloning Kit （NO.6011，TaKaRa），T4 DNA連接酶（EL0014，Thermo），E.coliDH5α感受態(tài)細胞（CW0808S，CWBIO），氨芐青霉素（A6140，Sigma），LB液體培養(yǎng)基，LB固體培養(yǎng)基，DL2000 DNA Marker（TSJ011-100,，TsingKe），DL5000 DNA Marker（TSJ012-100，TsingKe），SoSoo Cloning Kit（TSV-S1，TsingKe），Endo-free Plasmid DNA Mini Kit II（D6950-01，OMEGA），Gel Extraction Kit（D2500-01，OMEGA），TRIzol reagent（DP424,TIANGEN）、氯仿（500 mL，TIANGEN），異丙醇（500 mL，TIANGEN）。

1.2 引物設計 參考NCBI中收錄的家鴨CAPN1基因的mRNA序列（XM_027447352.1），使用Primer Premier 5.0軟件，參照PCR引物設計原則，利用同源重組原理將CAPN1基因的CDS序列分為CAPN1-a和CAPN1-b 2個片段分別設計引物擴增，引物序列見表1，由北京擎科生物公司進行合成。再設計菌液PCR引物（CAPN1-517），擴增大小為517 bp的片段，進行陽性克隆初步篩選。

1.3 RNA提取及檢測 在RNA提取前1 d，將剪刀、鑷子、研缽、研杵等器械全部清洗后，用DEPC水浸泡12 h，高壓滅菌，之后放入烘箱中100℃烘烤8 h，待使用時用液氮預冷。所用到的各類試劑、槍頭、離心管均要求無菌無酶。組織RNA提取采用Trizol法，按照試劑盒說明書進行操作。提取的RNA用1% 的瓊脂糖凝膠電泳快速檢測RNA的質(zhì)量，并用超微量分光光度計檢測其濃度和純度，選取A260/A280值在1.8～2.0范圍內(nèi)且電泳帶型完整的RNA用于后續(xù)實驗。

1.4 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行操作，以適量RNA為模板、Oligo（dT）18為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA。

1.5 PCR擴增 以黑番鴨腿肌總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，采用Q5高保真酶對CAPN1基因編碼區(qū)進行PCR擴增，反應體系為50 μL：cDNA模板（200 ng/μL）1.0 μL，上、下游引物（10 pmol/μL）各2.5 μL，Q5高保真酶（NEB）0.5 μL，5×high GC enhancer 0.5 μL，10Mm dNTPs 1.0 μL，5×Q5 Reaction Buffer 10 μL，加Rnase free ddH2O補足50 uL。PCR設定程序：98℃預變性5 min，然后進行35個循環(huán)（98℃變性30 s，62℃退火10 s，72℃延伸45 s），72℃后延伸2 min，最后4℃保存。

擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切取目的條帶，按照膠回收試劑盒說明書對PCR產(chǎn)物進行純化回收。

1.6 重組、轉(zhuǎn)化及陽性克隆鑒定 采用SoSoo重組克隆試劑盒，將純化后的PCR產(chǎn)物（CAPN1-a、CAPN1-b）與pMD18-T載體連接，連接體系為10 μL：Linearlized pMD18-T Vector（50 ng/uL，0.03 pmol）1.0 μL，CAPN1-a（0.1～0.3 pmol）1.0 μL，CAPN1-b （0.1～0.3 pmol）1.0 μL，2× SoSoo Mix 5.0 μL，加水補足至10 μL。

加入相關組分后，用移液器輕輕吹打混勻，低速瞬時離心所有液體至離心管底部，50℃反應15 min。然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，涂板在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng) 12 h。隨機挑取單克隆，用菌液PCR法和酶切質(zhì)粒法篩選陽性克隆，將挑選的陽性克隆送北京擎科生物公司測序。

1.7 序列分析 對測序得到的序列使用DNAStar中的SeqMan軟件進行序列拼接；使用NCBI中的ORF Finder工具查找開放閱讀框；使用BLAST程序進行同源性比對；使用MEGA 7.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹；使用ExPASy ProtParam工具分析CAPN1蛋白的理化性質(zhì)；使用ExPASy ProtScale工具分析CAPN1蛋白的親疏水性；使用TEMpred工具對CAPN1蛋白的跨膜區(qū)進行分析；使用SignalP-4.0工具預測信號肽；使用TargetP 1.1 Server工具預測亞細胞定位；使用NetPhos 3.1 Server工具預測磷酸化位點；使用NetOGlyc 4.0 Server工具預測O-糖基化位點；使用NetNGlyc 4.0 Server工具預測N-糖基化位點；使用SOPMA工具分析CAPN1蛋白的二級結構；使用NCBI的CDD工具預測CAPN1蛋白的結構域；使用SWISS-MODEL工具預測CAPN1蛋白的三級結構。

表1 引物序列

2 結果

2.1 黑番鴨CAPN1基因CDS區(qū)克隆

2.1.1 PCR擴增 由圖1可知，成功獲得大小為1 103 bp和1 068 bp條帶，目的條帶清晰，無雜帶，可用于后續(xù)實驗。

2.1.2 陽性克隆鑒定 菌液PCR檢測結果如圖2所示，有2個菌落鑒定結果為陽性。

將這2個菌落分別加入到5 mL含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖菌培養(yǎng)12 h，用于提質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒用BamHI和HindIII進行雙酶切后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果如圖3所示。由圖3可知，1號和2號質(zhì)粒經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切后，均形成了2 692 bp和2 148 bp 2個片段，檢測結果為陽性。將菌液PCR鑒定和質(zhì)粒酶切鑒定均為陽性的克隆，送北京擎科生物公司進行測序。

2.2 生物信息學分析

2.2.1 序列拼接及ORF查找 對測序得到的序列使用DNAStar中的SeqMan軟件進行序列拼接，拼接后得到一段長度為2 148 bp的序列。使用NCBI中的ORF Finder工具查找序列的開放閱讀框，結果發(fā)現(xiàn)CAPN1基因含有一個長度為2 148 bp的開放閱讀框，編碼715個氨基酸（圖4），將序列提交至GenBank，獲得登錄號為：MT419750.1。

2.2.2 同源性比對 同源性比對結果如表2所示，黑番鴨CAPN1基因核苷酸序列與鴨（Anas platyrhynchos）、雞（Gallus gallus）、雉雞（Phasianus colchicus）、人（Homo sapiens）、豬（Sus scrofa）、牛（Bos taurus）、綿羊（Ovis aries）、馬（Equus caballus）的同源性分別為98.70%、87.29%、86.11%、81.89%、81.62%、81.18%、81.04%、81.27%；黑番鴨CAPN1基因氨基酸序列與鴨（Anas platyrhynchos）、雞（Gallus gallus）、雉雞（Phasianus colchicus）、人（Homo sapiens）、豬（Sus scrofa）、牛（Bos taurus）、綿羊（Ovis aries）、馬（Equus caballus）的同源性分別為99.30%、91.47%、90.63%、83.22%、83.64%、83.10%、82.96%、83.36%（表3）。

2.2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析 通過NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫，檢索并下載另外8個物種的CAPN1基因編碼區(qū)（CDS）序列，連同測序得到的黑番鴨CAPN1基因編碼區(qū)序列，使用MEGA 7.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用ML（最大似然法）建樹，替換模型選擇Tamura 3-parameter，替換速率服從Gamma分布，結果如圖5所示，番鴨先與家鴨聚在一起，之后再與雞、雉雞聚在一起，最后與牛、羊聚在一起。

表2 黑番鴨CAPN1 基因核苷酸序列與其他物種的同源性比對

表3 黑番鴨CAPN1 基因氨基酸序列與其他物種的同源性比對

2.2.4 理化性質(zhì)分析 由理化性質(zhì)分析結果可知，亞細胞定位結果表明，黑番鴨CAPN1蛋白是線粒體靶向肽（mitochondrial targeting peptide，mTP）和分泌通路信號肽（secretory pathway signal peptide，SP）的概率分別是10%和12.7%，說明CAPN1蛋白無信號肽，不是分泌蛋白。CAPN1蛋白分布于細胞質(zhì)中的可能性為56.5%，分布于細胞核中的可能性為17.4%，分布于線粒體中的可能性為26.1%，預測可信度為94.1%，所以，CAPN1蛋白可能主要分布于細胞質(zhì)中。

2.2.8 修飾結構預測 對黑番鴨CAPN1蛋白可能的磷酸化位點進行預測，只有當氨基酸為絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸且閾值高于0.5時，才認為其是潛在的磷酸化位點，可知黑番鴨CAPN1蛋白共存在59個潛在的磷酸化位點，其中包括29個絲氨酸、8個酪氨酸、22個蘇氨酸。

對黑番鴨CAPN1蛋白可能的N-糖基化位點進行預測，發(fā)現(xiàn)黑番鴨CAPN1蛋白共有3個潛在的N-糖基化位點，分別位于第127、310、469位氨基酸處。

對黑番鴨CAPN1蛋白可能的O-糖基化位點進行預測，發(fā)現(xiàn)黑番鴨CAPN1蛋白共有9個潛在的O-糖基化位點，分別位于第12、15、66、67、77、80、89、379、532位氨基酸處。

2.2.9 結構分析 CAPN1蛋白二級結構預測結果如圖8所示，α-螺旋（Alpha helix，Hh）有301個氨基酸，占42.10%；β-轉(zhuǎn)角（Beta turn，Tt）有52個氨基酸，占7.27%；延伸鏈（Extended strand，Ee）有115個氨基酸，占16.08%；無規(guī)卷曲（Random coli，Cc）有247個氨基酸，占34.55%；以上4種結構貫穿于整個氨基酸鏈，但α-螺旋占比最高，β-轉(zhuǎn)角占比最低。

對番鴨CAPN1蛋白的結構域進行預測，結果如圖9所示，CAPN1蛋白包含3個結構域，分別為鈣蛋白酶催化結構域（Calpain catalytic domain，Peptidase_C2）、鈣蛋白酶亞結構域III（Calpain subdomain III，Calpain_III）、鈣調(diào)節(jié)蛋白結構域（Calpain domain，EFh_PEF_CAPN1）。

對黑番鴨CAPN1蛋白的三維結構進行預測，選擇人m-Calpain II型晶體結構（SMTL ID：1kfu.1.A）為模板，該模板與目的蛋白序列的一致度為63.18%，可以用做CAPN1蛋白三維結構的預測，預測結果如圖10所示。

3 討論

肌肉嫩度是非常重要的肉質(zhì)性狀，肌原纖維結構、肌肉細胞完整性、蛋白分解酶活性，甚至是屠宰前、屠宰后的不同時間階段等因素都會影響肌肉嫩度[4]。這些因素中關鍵肌原纖維蛋白的降解發(fā)揮著關鍵作用[12]。CAPN1基因是一種細胞內(nèi)鈣離子依賴性半胱氨酸蛋白酶，可以作用于肌原纖維以調(diào)控肌肉嫩度[13]。最初，CAPN1基因在肌肉蛋白降解過程中的作用在小鼠中被發(fā)現(xiàn)[14]。Geesink等[14]研究表明CAPN1基因敲除的小鼠表現(xiàn)出更強的蛋白積累能力。此后，Oliver等[15]再次驗證了敲除CAPN1基因的小鼠在30周齡時，蛋白質(zhì)積累能力顯著高于對照組。Cheong等[16]研究發(fā)現(xiàn)CAPN1基因的3'UTR區(qū)域與肌肉大理石紋密切相關；Casas[17]等發(fā)現(xiàn)CAPN1基因會影響肉的風味；Xin等[18]證實了CAPN1基因與肌肉的pH、脂肪酸和氨基酸含量有關。CAPN1基因還被證實通過修改靶蛋白的一級和二級結構特征從而參與細胞運動、信號轉(zhuǎn)導、凋亡、細胞分化和細胞骨架調(diào)控等重要過程[19]。目前，對于CAPN1基因的克隆在家豬[20]、雞[21]、牛[22-23]、山羊[24]等物種中已有報道，但是尚沒有關于番鴨CAPN1基因的研究。

本實驗成功克隆了黑番鴨CAPN1基因的編碼區(qū)序列。該序列包含一個2 148 bp的完整開放閱讀框，共編碼715個氨基酸，這與趙婧微[25]等克隆廣靈驢CAPN1基因的結果一致。此外，已有研究結果表明牦牛[22-23]和山羊[24]的CAPN1基因編碼區(qū)長均為2 151 bp，共編碼716個氨基酸，與本實驗研究結果相近；四川山地烏骨雞的CAPN1基因編碼區(qū)長度為2 115 bp，編碼705個氨基酸[21]，這與本實驗研究結果有較大差距。這些物種在核苷酸序列和氨基酸序列組成上的差異在一定程度上說明了親緣關系的遠近。理化性質(zhì)分析和親疏水性分析均表明CAPN1蛋白是親水性蛋白。這與家豬[20]、雞[21]、牛[22-23]、山羊[24]、廣靈驢[25]、鯉[26]等動物中的研究結果一致，說明本實驗結果可靠。信號肽是分泌蛋白特有的結構，極少超過45個氨基酸殘基[27-28]。所以本實驗只分析CAPN1蛋白N端70個氨基酸，結果表明番鴨CAPN1蛋白無信號肽，不是分泌蛋白，并且主要分布于細胞質(zhì)中。這些結果同已報道的家豬[20]、雞[21]、牛[22-23]、山羊[24]等動物CAPN1蛋白的預測結果完全一致。磷酸化和糖基化都是重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程，對蛋白質(zhì)結構和功能具有重要作用[29-32]。本實驗預測黑番鴨CAPN1蛋白存在3個潛在的N-糖基化位點。但是根據(jù)信號肽分析結果可知，CAPN1蛋白沒有信號肽，所以不太可能暴露于N-糖基化機制，因此即使它們含有潛在的N-糖基化基序，在體內(nèi)也可能不能被糖基化。蛋白質(zhì)二級結構指蛋白質(zhì)多肽鏈中形成的有規(guī)則重復的結構[34-35]。本實驗對黑番鴨CAPN1蛋白二級結構的研究結果與廣靈驢[25]中的研究結果相近，但與鯉[26]的研究結果不一致，可能是因為番鴨與廣靈驢在親緣關系上較近，與鯉在親緣關系上比較遠。結構域預測發(fā)現(xiàn)黑番鴨CAPN1蛋白包含3個結構域，其中鈣蛋白酶催化結構域包含催化位點，屬于CysPc超家族，位于第56～352位氨基酸處；鈣調(diào)節(jié)蛋白結構域包含Ca2+結合位點，屬于EFh_PEF超家族，位于第547～715位氨基酸處；鈣蛋白酶亞結構域III屬于Calpain_III超家族，位于第373～520位氨基酸處，有酸性環(huán)，將催化結構域和調(diào)節(jié)結構域連接起來。

4 結論

本實驗成功克隆了黑番鴨CAPN1基因CDS序列，得到一個長度為2 148 bp的片段，編碼715個氨基酸，將序列提交至GenBank，獲得登錄號為MT419750.1。生物信息學分析確定CAPN1蛋白是親水性蛋白，主要分布于細胞質(zhì)中，不是分泌蛋白，無信號肽，有3個保守結構域和4種二級結構。CAPN1蛋白雖有潛在的N-糖基化序列，但不能發(fā)生N-糖基化修飾。本實驗結論為進一步研究CAPN1基因功能和選育黑羽番鴨新品種提供理論依據(jù)。