發(fā)酵飼料對(duì)洛氏鱥生長(zhǎng)、免疫、抗氧化能力以及腸道菌群影響

趙云龍，葉梅燕，王嘉婧，于 婷，張東鳴

（1.通化師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，吉林通化 134000；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118）

洛氏鱥（Phoxinus lagowskiiDybowski）也叫柳根子，屬鯉形目（Cypriniformes）、鯉科（Cyprinidae）、雅羅魚亞科（Leuciscinae）、鱥屬（Phoxinus），是一種小型雜食性冷水魚，肉質(zhì)細(xì)嫩、美味又營(yíng)養(yǎng)，在小型魚類中頗具優(yōu)勢(shì)，深受消費(fèi)者青睞。目前，北方地區(qū)洛氏鱥的人工養(yǎng)殖面積越來越大，前景喜人。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)向綠色產(chǎn)業(yè)發(fā)展，對(duì)水產(chǎn)品的安全、無污染、無殘留的要求日益嚴(yán)格，微生物發(fā)酵飼料越來越受到重視，與傳統(tǒng)飼料相比，其優(yōu)勢(shì)在于可降低植物蛋白抗?fàn)I養(yǎng)因子含量，改善蛋白質(zhì)品質(zhì)，提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]。

蜜環(huán)菌（Armillaria mellea）屬于蘑菇目（Agaricales）、泡頭菌科（Physalacriaceae）、蜜環(huán)菌屬（Armillaria），具有極高營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值、能降低致病菌的入侵、調(diào)節(jié)免疫及抗氧化能力等多種效用，在藥品、保健品、功能食品等領(lǐng)域中廣泛的應(yīng)用[2]，但尚未見在魚類飼料領(lǐng)域中應(yīng)用。因此，為了對(duì)蜜環(huán)菌發(fā)酵飼料在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用效果進(jìn)行科學(xué)評(píng)估，本試驗(yàn)從生長(zhǎng)性能、免疫、抗氧化能力以及腸道菌群等方面入手，探討蜜環(huán)菌發(fā)酵飼料對(duì)洛氏鱥生長(zhǎng)性能及生理功能的影響，為蜜環(huán)菌發(fā)酵飼料在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用和新型水產(chǎn)飼料資源的開發(fā)提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料 4種發(fā)酵飼料原料組成及營(yíng)養(yǎng)成分如表1所示。豆粕為蛋白質(zhì)源，豆油和麥麩為脂肪源，青菜為維生素源?；A(chǔ)飼料中分別添加0、6、12、18 mL/kg蜜環(huán)菌菌液。原料進(jìn)行粉碎后，按配方的各原料比例稱重充分混勻，滅菌后在超凈臺(tái)上接入蜜環(huán)菌菌液，密封后在暗處發(fā)酵48 h（20℃）后，制成長(zhǎng)度約3～4 mm的顆粒料，置于陰涼處風(fēng)干，放入4℃的冰箱保存。蜜環(huán)菌菌液是以馬鈴薯、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、葡萄糖、蠶蛹粉和維生素B1作為底物，接種蜜環(huán)菌發(fā)酵而成。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理 經(jīng)過1周馴養(yǎng)后，將360尾外觀正常、健康活潑、初始體重量為（20.85±2.04）g、體長(zhǎng)為（118.7±9.7）mm的洛氏鱥，隨機(jī)分成4組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾洛氏鱥，置于養(yǎng)殖容器（聚乙烯塑料水族箱，規(guī)格為75 cm×60 cm×50 cm）。

表1 基礎(chǔ)飼料原料組成及營(yíng)養(yǎng)成分

養(yǎng)殖期間按洛氏鱥平均體重的1% 投喂，每天08:00和17:00投喂。每隔1周測(cè)1次洛氏鱥的總重以調(diào)整投喂量。養(yǎng)殖用水先經(jīng)曝氣，每周換水1次（全部）。養(yǎng)殖期間水質(zhì)條件為（18±2）℃、pH 7.0～7.5、溶解氧含量大于5.0 mg/L、氨氮含量小于0.01 mg/L、硫化物小于0.05 mg/L。養(yǎng)殖13周后，停止喂食，24 h后收集樣品。

1.3 采樣與分析

1.3.1 生長(zhǎng)指標(biāo) 參考鐘小群等[3]測(cè)定方法。

成活率（SR）=Nt/N0×100%

增重率（WGR）=（Wt－W0）/W0×100%

特定生長(zhǎng)率（SGR，%/d）=（lnWt－lnW0）/T×100

飼料系數(shù)（FCE）=F/（Wt－W0）

肥滿度（CF，g/cm3）=Wt/L3×100

式中，N0為初始魚尾數(shù)，Nt為末魚尾數(shù)，W0為試驗(yàn)開始時(shí)魚體總重（g），Wt為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)魚體總重（g），F(xiàn)為攝食量（g），T為養(yǎng)殖時(shí)間（d），L為末時(shí)魚的體長(zhǎng)（cm）。

1.3.2 免疫和抗氧化指標(biāo) 樣品測(cè)定數(shù)量為3尾/ 箱。解剖取肝臟，用吸水紙將采集的肝臟擦干，精準(zhǔn)稱取組織，冰浴條件下，按體積（mL）:質(zhì)量（g）為9:1的比例加入9倍體積生理鹽水，使用玻璃研磨器磨碎，裝進(jìn)離心管，4℃ 2 500 r/min離心10 min，取上清液。采用南京建成生物工程研究所試劑盒，測(cè)定肝臟溶菌酶（LZM）、超氧化物歧化酶（SOD）和總抗氧化能力（T-AOC），具體方法參照試劑盒說明書。

1.3.3 腸道微生物菌群 9尾/組（每箱3尾，混合）。每箱隨機(jī)采集3尾魚在無菌操作臺(tái)中取出腸道部分；用無菌鑷子擠出內(nèi)容物后，將腸道剪開并用塑料刮板刮取腸道黏膜，將3尾魚的腸道內(nèi)容物和腸道黏膜樣品混合存放于1.5 mL無菌Eppendorf管中并置于液氮中保存，共計(jì)12個(gè)樣。根據(jù)16S rRNA基因V3～V4區(qū)序列，選擇測(cè)序引物為341F：（5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′）和806R：（5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′）。純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物在上海元莘生物醫(yī)藥科技有限公司通過Illumina PE250測(cè)序。通過比對(duì)Silva核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)，以97%相似性水平為標(biāo)準(zhǔn)劃分可操作分類單元（OUT），并采用RDP classifier貝葉斯算法進(jìn)行分類學(xué)分析，在門（Phylum）和屬（Genus）分類水平統(tǒng)計(jì)各樣品的群落組成，利用Mothur軟件和R語(yǔ)言工具分別進(jìn)行多樣性分析、物種組成和結(jié)構(gòu)分析等。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），利用Duncan′s法進(jìn)行多重比較，顯著水平為P＜0.05。數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度蜜環(huán)菌發(fā)酵飼料對(duì)洛氏鱥生長(zhǎng)指標(biāo)的影響如表2所示，4組洛氏鱥均無死亡，隨著蜜環(huán)菌菌液添加量的增加，洛氏鱥的WGR、SGR和CF均呈先升高后降低趨勢(shì)，F(xiàn)CE則呈先降低后升高趨勢(shì)，其中6、12、18 mL/kg蜜環(huán)菌組CF與0 mL蜜環(huán)菌組存在顯著差異。6、12 mL/kg蜜環(huán)菌組在WGR、SGR、FCE和CF表現(xiàn)較優(yōu)，然而18 mL/kg蜜環(huán)菌組在WGR、SGR和FCE表現(xiàn)最差。

表2 不同濃度蜜環(huán)菌發(fā)酵飼料對(duì)洛氏鱥生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

2.2 不同濃度蜜環(huán)菌發(fā)酵飼料對(duì)洛氏鱥免疫和抗氧化指標(biāo)的影響 由表3可見，洛氏鱥肝臟LZM活性隨著蜜環(huán)菌菌液添加量的增加而升高，6、12、18 mL/kg蜜環(huán)菌組顯著高于0 mL/kg蜜環(huán)菌組，且3組之間存在顯著差異。洛氏鱥肝臟的SOD活性隨著蜜環(huán)菌菌液添加量的增加而升高，6、12、18 mL/kg蜜環(huán)菌組顯著高于0 mL/kg蜜環(huán)菌組，但6、12 mL/kg蜜環(huán)菌組不存在顯著差異。洛氏鱥肝臟T-AOC隨著蜜環(huán)菌菌液添加量的增加而呈先上升后下降的趨勢(shì)，12 mL/kg蜜環(huán)菌組最大，與0 mL/kg蜜環(huán)菌組間存在顯著差異，但與6、18 mL/kg蜜環(huán)菌組無顯著差異。

表3 不同濃度蜜環(huán)菌發(fā)酵飼料對(duì)洛氏鱥免疫和抗氧化指標(biāo)的影響

2.3 不同濃度蜜環(huán)菌發(fā)酵飼料對(duì)洛氏鱥腸道菌群物種組成和結(jié)構(gòu)的影響 由洛氏鱥腸道樣品門水平聚類樹與柱狀圖組合分析圖可知（圖1），6、12 mL/kg蜜環(huán)菌組之間群落結(jié)構(gòu)相似度最高，其次18 0 mL/kg蜜環(huán)菌組最低。飼喂發(fā)酵飼料后洛氏鱥腸道菌群門水平結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，主要涉及變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和梭桿菌門（Fusobacteria）。在0～18 mL/kg蜜環(huán)菌組4組洛氏鱥腸道中，變形菌門均占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，但蜜環(huán)菌發(fā)酵飼料飼喂使其豐度降低（90.84%～ 73.13%），之后擬桿菌門（2.43%～ 10.11%）和厚壁菌門（2.30%～ 12.78%）豐度增加，放線菌門豐度降低（3.28%～2.18%）。在屬的分類水平上（圖2），4組洛氏鱥腸道樣品共涉及298個(gè)屬，其中0、6、12、18 mL/kg蜜環(huán)菌組分別涉及179、180、210、142個(gè)屬，鞘氨酸單胞菌屬（Sphingomonas）、Caulobacteraceae_uncultured屬和固氮螺菌屬（Azospirillum）是4組洛氏鱥腸道菌群的優(yōu)勢(shì)菌屬。與0 mL/kg蜜環(huán)菌組相比，6、12、18 mL/kg蜜環(huán)菌組飼喂發(fā)酵飼料后洛氏鱥腸道菌群屬水平結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，鞘氨酸單胞菌屬（39.46%～20.30%）、Caulobacteraceae_uncultured屬（17.30%～7.01%）豐度逐漸下降，而固氮螺菌屬（4.27%～15.45%）逐漸增大。

3 討論

3.1 發(fā)酵飼料對(duì)洛氏鱥生長(zhǎng)影響 20世紀(jì)60年代初期就有學(xué)者將微生物添加到飼料中，發(fā)酵后的飼料具有適口性強(qiáng)、消化吸收利用率高等特點(diǎn)[4]，且天然的醇香味具有很好的誘食作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加蜜環(huán)菌發(fā)酵的飼料對(duì)洛氏鱥的WGR和AGR、FCE以及CE均有利。原因可能是經(jīng)過發(fā)酵后，豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子得到有效降解，同時(shí)部分大分子蛋白被降解成魚類可直接消化吸收的小分子蛋白、小肽和氨基酸，飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得以改善，進(jìn)而提高了動(dòng)物機(jī)體的利用率[5]。

3.2 發(fā)酵飼料對(duì)洛氏鱥免疫和抗氧化能力的影響 魚類生活在水中，為特殊生境，因此在抵抗病害方面，與特異性免疫機(jī)制相比，非特異性免疫機(jī)制更為重要[6]。LZM具有較強(qiáng)抗菌、抑菌功能[7]，破壞病原菌細(xì)胞壁[8]，在魚類啟動(dòng)免疫保護(hù)機(jī)制時(shí)發(fā)揮重要作用。SOD普遍存在于細(xì)胞漿及線粒體基質(zhì)中，是一種能清除活性氧自由基的重要抗氧化酶類，能加強(qiáng)免疫能力[9]。T-AOC包括抗氧化酶和非酶促抗氧化2部分，作用主要是消除活性氧自由基避免引發(fā)脂質(zhì)過氧化、分解過氧化物阻斷過氧化鏈和除去起催化作用的金屬離子等，是魚類抗氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志性指標(biāo)[10]。肝臟是洛氏鱥的代謝活動(dòng)中心，免疫和抗氧化能力變化直接關(guān)系到整個(gè)機(jī)體的功能。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，12 mL/kg蜜環(huán)菌組發(fā)酵飼料可顯著提高洛氏鱥肝臟LZM和SOD活性，提高T-AOC，說明蜜環(huán)菌發(fā)酵飼料對(duì)洛氏鱥肝臟的免疫和抗氧化功能起到了積極的調(diào)控作用，可刺激機(jī)體的非特異性反應(yīng)，進(jìn)而提高免疫和抗氧化機(jī)能。一方面可能是蜜環(huán)菌發(fā)酵使基礎(chǔ)飼料中的小分子蛋白、肽類和游離氨基酸含量相對(duì)較高，增強(qiáng)了機(jī)體的非特異性免疫力；另一方面可能是蜜環(huán)菌大量繁殖，被利用后增強(qiáng)了機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫機(jī)能。

3.3 發(fā)酵飼料對(duì)洛氏鱥腸道菌群影響 洛氏鱥腸道優(yōu)勢(shì)菌群中排前5位的門分別是變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門和梭桿菌門。這5門在異育銀鯽[11]、羅非魚[12]和草魚[13]的腸道優(yōu)勢(shì)菌群中都有不同程度的檢出；也是魚類腸道中主要的好氧、兼性厭氧和專性厭氧菌類群[14-15]。魚類腸道微生物的構(gòu)成不僅與宿主的特性密切相關(guān)，還與飲食和生活環(huán)境的多樣性相關(guān)[16]，如Ray等[17]和Liu等[18]均利用454焦磷酸測(cè)序技術(shù)研究羅非魚腸道菌群，前者結(jié)果顯示優(yōu)勢(shì)菌群為梭桿菌門、擬桿菌門和變形菌門，而后者則顯示優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門、厚壁菌門、梭桿菌門和放線菌門。變形菌門是細(xì)菌中最大的一門，普遍存在于海洋生物腸道之中，是羅非魚腐敗過程中的優(yōu)勢(shì)菌門[19]，其含量過高會(huì)破壞腸道微生態(tài)環(huán)境，增加機(jī)體患病可能性[20]；在厭氧條件下，某些變形菌與動(dòng)物形成共生關(guān)系，參與環(huán)境中的碳和硫循環(huán)[21]。擬桿菌門與DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等有機(jī)物的轉(zhuǎn)換密切相關(guān)，并參與糖類、膽汁酸和類固醇代謝[22]。厚壁菌門在宿主腸道中被認(rèn)為是促進(jìn)纖維素分解[23]和幫助多糖發(fā)酵[24]的重要菌群。放線菌門屬于條件致病菌，某些營(yíng)腐生生活菌可分泌許多胞外酶和次生代謝產(chǎn)物等物質(zhì)參與自然界氮素循環(huán)，而某些放線菌為致病菌，可在機(jī)體免疫能力低時(shí)侵染機(jī)體，產(chǎn)生慢性或亞急性疾病[25-26]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，12 mL/kg蜜環(huán)菌組發(fā)酵飼料中變形菌門和放線菌門豐度降低，厚壁菌門和擬桿菌門豐度提高。鞘氨酸單胞菌屬微生物能夠被動(dòng)物T細(xì)胞識(shí)別，使動(dòng)物免疫力降低，進(jìn)而感染各種疾病[27]，Caulobacteraceae_uncultured屬細(xì)菌在無氮環(huán)境中豐度較高[28]，而固氮螺菌屬細(xì)菌則是一類介于自生固氮和共生固氮之間的微生物。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，12 mL/kg蜜環(huán)菌組發(fā)酵飼料使鞘氨酸單胞菌屬和Caulobacteraceae_uncultured屬豐度逐漸下降，固氮螺菌屬逐漸增大。這表明蜜環(huán)菌發(fā)酵飼料可以優(yōu)化腸道菌群豐度，增強(qiáng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)換和吸收，有利于洛氏鱥健康?？赡苁抢妹郗h(huán)菌發(fā)酵其菌體蛋白質(zhì)提高了基礎(chǔ)飼料生態(tài)質(zhì)量。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)在基礎(chǔ)飼料中添加12 mL/kg蜜環(huán)菌菌液，發(fā)酵48 h（20℃）制成蜜環(huán)菌發(fā)酵飼料飼喂效果最好，可提高洛氏鱥生長(zhǎng)性能、免疫和抗氧化能力，改變腸道菌群豐度，促進(jìn)有益菌繁殖，但不改變腸道細(xì)菌親緣關(guān)系。因此，進(jìn)一步研究蜜環(huán)菌發(fā)酵飼料在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用十分必要，為新型水產(chǎn)飼料資源的開發(fā)提供基礎(chǔ)理論依據(jù)和參考。