連續(xù)活體采卵對水牛卵母質(zhì)量的影響

覃廣勝，趙朝步，陳明棠，黃 健，李 輝，譚正準，鐘華配，黃加祥

（中國農(nóng)業(yè)科學院廣西水牛研究所，農(nóng)業(yè)部（廣西）水牛遺傳繁育重點實驗室，廣西南寧 530001）

水牛是一種重要的家畜資源，它在很多欠發(fā)達的農(nóng)業(yè)體系中占據(jù)著重要的位置，為人們提供奶、肉，也可作役力。水牛主要繁殖特點是超排反應差[1]、可移植胚胎的回收率以及懷孕率低，同樣也存在青春期延遲、發(fā)情癥狀不明顯、季節(jié)性乏情期等[1]以及產(chǎn)后長時間的乏情期[2-4]等生理特性問題。從長遠來看，活體采卵（OPU）和體外胚胎生產(chǎn)（IVEP）是目前生產(chǎn)可轉(zhuǎn)移胚胎（TE）的最具競爭力的技術[5-8]。此外，可以利用OPU對非周期牛、懷孕奶牛以及輸卵管或生殖道感染的牛開展研究[7,9]。也可以在對超排沒有反應的動物中進行（尤其是水牛）[10]。因此，該方法是超排/胚胎移植（MOET）計劃的有效替代方案[8]。由于水牛對激素刺激的反應低，胚胎回收率低[1,8,11]，而且不可能長期重復MOET處理。因此，將OPU-IVEP技術應用于水牛可以提高母親對遺傳改良的貢獻[8,11]，從而克服與水牛繁殖季節(jié)有關的效率降低的問題。本研究探討了OPU重復次數(shù)對水牛卵母細胞質(zhì)量的影響，旨在提高水牛胚胎的體外生產(chǎn)效率，為建立高效的水牛胚胎體外培養(yǎng)體系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料 如果無其他說明，所有化學品和試劑（主要包括青霉素、鏈霉素、肝素鈉、TCM199培養(yǎng)基等）為Sigma公司生產(chǎn)。胎牛血清購自Gibco BRL（Paisley，Scotland，UK）。

1.2 實驗動物和活體采卵程序 實驗水牛選自廣西水牛研究所水牛種畜場，共92頭水牛（摩拉27頭、尼里-拉菲30頭和雜交水牛35頭），4～12歲，體重580～700 kg。活體采卵程序按照報道[5,7,12]方法進行。活體采卵儀為日本Honda公司生產(chǎn)的HS2000 B型超聲波顯像儀；配有7.5/5.0 MHz扇形陰道掃描探頭（Aloka公司），19G采卵針（針長60 cm，管長120 cm，日本生產(chǎn)），真空泵（FHK，日本富士平公司），恒溫槽（日本富士平公司）；50 mL卵泡液收集管。穿刺前測定每個卵巢內(nèi)卵泡的數(shù)目和大小。將直徑≥3 mm卵泡穿刺，在真空壓力為50 mmHg的條件下，將卵泡液回收50 mL管收集管中。OPU每隔3 d進行1次，連續(xù)進行5次。

1.3 卵丘-卵母細胞復合體處理 采卵液含DPBS+3%胎牛血清+100 μg/mL青霉素+60 mg/mL鏈霉素+10 IU/mL肝素。TCM199培養(yǎng)基含5%NBS。根據(jù)卵丘細胞復合體（COCs）的形態(tài)特征，按張秀芳等[13]提出的方法對卵母細胞進行分類。COCs可分為4類：A級（有兩層以上卵丘細胞和均質(zhì)細胞質(zhì)的卵母細胞）；B級（至少有一層卵丘細胞和同質(zhì)細胞質(zhì)的卵母細胞）；C級（部分剝落的卵母細胞，但仍顯示胞質(zhì)均一）；D級（細胞質(zhì)不規(guī)則皺縮的退化卵母細胞）。A級和B級COCs在體外成熟培養(yǎng)基（TCM199+10%FBS+10 μg/mL FSH+12 U/mL LH+1 μg/mL E2+50 μmol/L半胱氨酸）中，于39℃、5%CO2濕化氣氛中培養(yǎng)22～24 h[14]。

1.4 統(tǒng)計分析 統(tǒng)計計算連續(xù)OPU獲得的回收卵母細胞和優(yōu)質(zhì)卵母細胞的比例。統(tǒng)計尼里-拉菲、摩拉以及雜交水牛不同批次回收回收卵母細胞和優(yōu)質(zhì)卵母細胞的比例。應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計，以不同批次為固定因子，A、B、C、D及頭均可視卵泡數(shù)為因變量，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進行顯著性檢驗，以P＜0.05作為顯著性判斷標準，差異顯著的采用Duncan′s法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

表1顯示，連續(xù)5次活體采卵時，第1次卵母細胞回收率（65.91%）顯著高于第2～5次卵母細胞，而第2、3、4、第5次之間差異不顯著，這可能是第1次卵母細胞可穿刺的中等卵母細胞比第2～5次卵母細胞多，便于穿刺，回收率高，而第2～5次小卵泡多。優(yōu)質(zhì)卵母細胞（A+B級）1～5次的回收率分別為55.64%、64.05%、70.28%、69.30%、67.65%，優(yōu)質(zhì)卵母細胞的平均百分率為66.05%。進行連續(xù)活體采卵時，第1、2次優(yōu)質(zhì)卵母細胞的百分率比第3、4、5次效果差，第1、2次的優(yōu)質(zhì)卵母細胞的百分率與其他批次優(yōu)質(zhì)卵母細胞百分率差異顯著。第1次活體采卵回收C級卵母細胞（裸卵和網(wǎng)狀細胞）所占比例（39.76%）最大，與第2、3、4、5次差異顯著。隨著重復OPU次數(shù)的增加，D級卵母細胞（裸卵和網(wǎng)狀細胞）所占的比例不斷減少。

從表2可看出，尼里-拉菲水牛C級卵母細胞隨著活體采卵次數(shù)增加，所占的比例不斷減少，第1次活采所占的比例最大與第2、3、4、5次差異顯著；優(yōu)質(zhì)卵母細胞（A+B級）回收率第2、3、4、5次分別是70.49%、77.71%、69.80%、65.06%，顯著高于第1次回收率（52.50%）。摩拉水牛C級卵母細胞變化規(guī)律與尼里-拉菲水牛相近，第1次活體采卵C級回收率占比例達47.92%，與第2、3、4、5次差異顯著；優(yōu)質(zhì)卵母細胞（A+B級）回收率在48.43%～79.76%，第1次與第2、3、4、5次差異顯著。第1次卵母細胞回收效果最好（63.06%），與其余4次差異顯著。從表2也可看出，雜交水牛A級卵母細胞回收率比尼里-拉菲和摩拉水牛好，并且效果相對穩(wěn)定，而第1次的卵母細胞回收率（70.95%）與第2、3、4、5次差異顯著。總而言之，不同水牛品種在C級、優(yōu)質(zhì)卵母細胞回收率和卵母細胞回收率不同。

3 討論

3.1 連續(xù)活體采卵對卵母細胞回收率的影響 卵母細胞回收率受多種因素影響，如活體采卵頻率等。黃右軍等[15]報道，第1次活體采卵回收率為78.5%，第2次回收率為62.0%，第3次為51.2%。梁賢威等[16]報道，連續(xù)活體采卵第1、2、3次采卵平均穿刺卵泡數(shù)和頭均回收的卵母細胞數(shù)雖存在差異，摩拉水牛卵母細胞回收率為70.02%，尼里-拉菲水牛為67.41%。而本實驗進行連續(xù)5次活體采卵時，卵母細胞回收百分率比梁賢威等[16]的結(jié)果低（65.91%、48.16%、43.54%、50.77%和47.31%），但連續(xù)活體采卵，卵母細胞的回收率隨著采卵次數(shù)增加而呈下降趨勢，這與黃右軍等[15]報道的結(jié)果相近。陳明棠等[17]對富鐘水牛進行活體采卵，發(fā)現(xiàn)隨著活體采卵次數(shù)增加，卵母細胞回收率下降。許紅喜等[18]對雪龍黑牛的活體采卵結(jié)果表明，每周采卵1次，第1次卵母細胞回收率70%，第2次采卵回收率44%。這可能是第1次穿刺卵母細胞中等卵泡數(shù)量比第2、3、4、5次多，便于穿刺。另外，隨著穿刺次數(shù)增加，卵母細胞募集速度變慢，所以可視卵泡數(shù)量減少。加上穿刺次數(shù)增加，卵巢受損增加，導致卵泡數(shù)量減少，從而回收率下降。

表1 采卵批次對活體采卵卵母細胞質(zhì)量的影響

表2 不同品種連續(xù)活體采卵對卵母細胞質(zhì)量的影響

3.2 連續(xù)活體采卵對優(yōu)質(zhì)卵母細胞回收率的影響 本實驗研究結(jié)果表明，第1次活體采卵的優(yōu)質(zhì)卵母細胞百分率最差，第2次不斷增加，第3、4、5次保持相對穩(wěn)定。這可能與各批次之間C級卵母細胞變化相關，本實驗中隨著活體采卵次數(shù)增加，C級卵母細胞（裸卵和網(wǎng)狀細胞）所占的比例不斷減少。本研究平均優(yōu)質(zhì)卵母細胞（A+B級）的百分率為66.05%，與梁賢威等[16]報道優(yōu)質(zhì)卵母細胞回收率為70.92%相似，與Yadav等[19]報道的經(jīng)馬絨毛膜促性腺激素（eCG）處理的摩拉母水牛活體采卵回收率（71.60%）以及未經(jīng)處理的摩拉水牛卵母細胞平均回收率（64.18%）結(jié)果相似。比Di Francesco等[20]報道對意大利地中海水牛開展活體采卵效果好，其優(yōu)質(zhì)卵母細胞百分率在52.7%～65.6%。本研究的結(jié)果表明，第1次活體采卵優(yōu)質(zhì)卵母細胞百分率低的原因，可能是由于第1次比其他各次的閉鎖卵泡較多，加上水牛卵母細胞透明帶脆弱和顆粒細胞與卵母細胞之間的連接不緊密相關，這與Le Van Ty等[21]報道卵泡閉鎖水平較高的觀點一致。隨采卵次數(shù)增加，閉鎖卵泡減少，C和D級卵母細胞所占比例減少，卵母細胞質(zhì)量提高，因而回收的可用卵母細胞比例也隨之增加。

3.3 不同品種水牛連續(xù)活體采卵對采卵效果的影響 本實驗表明，尼里-拉菲水牛連續(xù)5次采卵，各批次卵母細胞回收率差異不顯著，但優(yōu)質(zhì)卵母細胞百分率差異顯著，第1次與第2、3次和5次相比回收效果最差；對卵母細胞回收率而言，摩拉水牛第1次回收效果最好，達63.06%，而其余各次回收率分別是46.32%、35.69%、47.01%、45.54%；優(yōu)質(zhì)卵母細胞百分率在48.43%～79.76%，第1次與其余各次間差異顯著；但雜交水牛回收卵母細胞率、優(yōu)質(zhì)卵母細胞回收率差異不顯著。與梁賢威等[16]報道的尼里拉菲、摩拉水牛卵母細胞回收率（67.41%、70.02%）相比差異較大。但比阿根廷的摩拉水?；铙w采卵[23]效果好，其連續(xù)對摩拉水?；铙w采卵6次，每次間隔7 d和14 d，平均每次卵母細胞回收率分別是31.5%、51%。優(yōu)質(zhì)卵母細胞回收率與富鐘水牛[17]也有差異（激素處理組回收率為70.88%，未處理組為60.2%）。但與Neglia等[23]報道連續(xù)18次（每周采卵2次）活采非泌乳的地中海水牛優(yōu)質(zhì)卵母細胞（A+B級）平均回收率58.5% 相接近。Gimenes等[24]報道，用同期發(fā)情方法處理3個品種青年牛的第5、7、9天后進行活體采卵，結(jié)果表明巴西的瘤牛、荷斯坦牛和水牛卵母細胞回收率分別是82.3%、66.7%、72.5%，優(yōu)質(zhì)卵母細胞回收率分別是68.8%、57.7%、60.9%，瘤?；铙w采卵效果比水牛和荷斯坦牛效果好，這是由于瘤牛的可視卵泡數(shù)比奶牛和水牛的多?？偠灾煌贩N之間，水?；铙w采卵效果不一致。

4 結(jié)論

隨著連續(xù)活體采卵次數(shù)增加，對水牛卵母細胞回收率有影響，而且可使水牛卵母細胞質(zhì)量得到提高，優(yōu)質(zhì)卵母細胞數(shù)量增加；不同品種水牛連續(xù)活體采卵，優(yōu)質(zhì)卵母細胞百分率和卵母細胞回收率不同。