卵黃在湖羊精液常溫保存中的作用效果

張柳明，Tariq Sohail，馬金亮，馮云奎，褚長(zhǎng)江，李擁軍

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇省動(dòng)物遺傳繁育與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009）

湖羊（Hu sheep）是世界著名的多胎綿羊（Ovis aries）品種，具有四季發(fā)情、一年兩胎和生長(zhǎng)發(fā)育快等優(yōu)點(diǎn)。人工授精技術(shù)是家畜繁殖中的一項(xiàng)基本技術(shù)，能夠充分利用優(yōu)良種公畜的精液[1-3]。精液保存則是人工授精技術(shù)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，精液保存通常分為常溫保存、低溫保存和冷凍保存[4-5]。在實(shí)際生產(chǎn)中，精液保存大多采用常溫保存，其具有處理操作過(guò)程簡(jiǎn)單和無(wú)需特殊的控溫設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)。精液的低溫保存和超低溫冷凍保存通常都添加卵黃，在豬、狗和兔等物種的精液稀釋液中也都有添加應(yīng)用[6-7]。不同的卵黃（如雞蛋、鴨蛋等）在不同哺乳動(dòng)物的精液保存中也都有應(yīng)用[8]。卵黃中的低密度脂蛋白聚集在精子膜表面，減少了精子的冷休克，在精液冷凍保存中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[9]。除此之外，卵黃可以調(diào)節(jié)稀釋液中的滲透壓和電解質(zhì)濃度，使其環(huán)境適宜精液保存，延長(zhǎng)了精子存活時(shí)間[10]。

在湖羊精液的常溫保存中添加卵黃鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)使用添加不同濃度卵黃的稀釋液對(duì)湖羊精液進(jìn)行常溫保存，采用計(jì)算機(jī)精子輔助分析儀（CASA）對(duì)精液保存期間的活率、活力以及一些運(yùn)動(dòng)參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，旨在客觀評(píng)價(jià)卵黃對(duì)湖羊精液常溫保存的效果，以期為湖羊精液保存技術(shù)在生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器設(shè)備 Tris、檸檬酸、果糖均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；青霉素鈉、鏈霉素硫酸鹽均購(gòu)自源葉生物（上海）科技有限公司。邁郎精子全自動(dòng)分析系統(tǒng)（CASA）購(gòu)自南寧松景天倫生物科技有限公司；電熱恒溫水浴鍋購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；恒溫箱購(gòu)自于慈溪市城康電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)精液 本實(shí)驗(yàn)所用精液為揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)羊場(chǎng)的3只1～2歲健康湖羊的混合精液，其體型外貌良好，精液品質(zhì)良好，成年公羊每周采集精液3次。

1.3 精液稀釋液的配制 準(zhǔn)確稱取Tris 15.35 g、檸檬酸8.20 g、果糖10.00 g，溶解于500.00 mL滅菌超純化水中，充分混勻，使用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，之后加入青霉素、鏈霉素各25萬(wàn)IU，配制成基礎(chǔ)稀釋液。分別取100、95、90、85、80 mL基礎(chǔ)稀釋液，用5 mL注射器向其中分別添加0、5、10、15、20 mL卵黃。將稀釋液放入冰箱過(guò)夜使其充分溶解，然后10 000 r/min，4℃條件下離心20 min，離心后將上清液分裝即得到卵黃濃度分別為0（對(duì)照組）、5%、10%、15%、20%的稀釋液，置于4℃冰箱保存，待用。

1.4 精液的采集和處理 采用假陰道法采集公羊精液，采精結(jié)束后放入37℃保溫杯中，1 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。選取色澤乳白、無(wú)異常氣味和射精量正常的精液，使用計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)（CASA）來(lái)檢測(cè)精子活力，選擇精子活力在75% 以上的精液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將合格的精液混勻，使用1.5 mL離心管，每管分裝130 μL精液，用已經(jīng)37℃預(yù)熱的不同卵黃濃度的稀釋液稀釋10倍，然后用多層棉花包裹，置于16℃恒溫箱中保存，每隔24 h針對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 精子質(zhì)量檢測(cè) 每隔24 h從10倍稀釋保存的各個(gè)離心管中取出20 μL精液，使用0.9%的生理鹽水再次稀釋5倍，置于37℃水浴鍋孵育2 min后，采用CASA檢測(cè)精子活率、活力以及運(yùn)動(dòng)參數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 利用SPSS 25.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），處理結(jié)果以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果分析

2.1 在常溫保存下不同濃度卵黃對(duì)湖羊精子活率的影響由表1可知，保存24～72 h，5% 和10% 卵黃組的精子活率較對(duì)照組有所提高（P＞0.05），15% 和20% 卵黃組精子活率降低（P＞0.05）；保存96 h，5%、10% 和15% 卵黃組精子活率提高（P＞0.05），20% 卵黃組精子活率降低（P＞0.05）；保存120～240 h，各卵黃添加組精子活率均有提高且在144～216 h存在顯著差異。

保存24～72 h、120～144 h，5%卵黃組的精子活率最高且在24～72 h時(shí)顯著高于15% 和20% 卵黃組，在120～144 h顯著高于對(duì)照組；保存96 h，10%卵黃組的精子活率最高且顯著高于20% 卵黃組；保存168 h，15%卵黃組的精子活率最高且顯著高于對(duì)照組和5%卵黃組；保存192～240 h，20%卵黃組的精子活率最高且顯著高于對(duì)照組、5%和10%卵黃組。

2.2 在常溫保存下不同濃度卵黃對(duì)湖羊精子活力的影響 由表2可知，保存24～96 h，與對(duì)照組相比，5%和10%卵黃組精子活力提高，15%和20%卵黃組精子活力降低；保存120～240 h，各卵黃添加組精子活力均有提高且在144～216 h存在顯著差異。

保存24～72 h、120～144 h，5% 卵黃組的精子活力最高且在24～72 h顯著高于15%和20%卵黃組，在120～144 h顯著高于對(duì)照組；保存96 h，10%卵黃組的精子活力最高且顯著高于20%卵黃組；保存168～192 h，15%卵黃組的精子活力最高且顯著高于對(duì)照組和5%卵黃組；保存216～240 h，20%卵黃組的精子活力最高且顯著高于對(duì)照組、5% 和10% 卵黃組。對(duì)照組的精子活力從96 h開始快速下降，5%卵黃組從120 h開始快速下降，10% 和15% 卵黃組從168 h開始快速下降，20%卵黃組的精子活力下降相對(duì)平穩(wěn)。

2.3 在常溫保存下不同濃度卵黃對(duì)湖羊精子運(yùn)動(dòng)性能的影響 由表3可知，保存72 h，5%卵黃組的精子直線速率最高（P＞0.05）；保存96 h，10% 卵黃組的精子直線速率、曲線速率、路徑速率和側(cè)擺幅度最高且顯著高于對(duì)照組和其余添加組；保存120 h，20%卵黃組的精子直線速率、曲線速率、路徑速率和側(cè)擺幅度最高且顯著高于對(duì)照組和5% 卵黃組；保存192 h，15% 卵黃組的精子直線速率、曲線速率、路徑速率和側(cè)擺幅度最高且顯著高于對(duì)照組和5% 卵黃組；保存216 h，20%卵黃組的精子直線速率、曲線速率、路徑速率和側(cè)擺幅度最高且顯著高于對(duì)照組、5%和10%卵黃組，且此時(shí)的線性度和前向性也最高（P＞0.05）；保存96～240 h，各卵黃組均提高了精子的直線速率、曲線速率、路徑速率和側(cè)擺幅度且在120～240 h存在顯著差異。

表1 在常溫保存下不同濃度卵黃對(duì)湖羊精子活率的影響 %

3 討論

卵黃中的主要物質(zhì)包括卵磷脂、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白，其中卵磷脂和低密度脂蛋白對(duì)精液保存起到保護(hù)作用，高密度脂蛋白會(huì)影響精液保存效果[11-12]。卵黃是大分子非滲透性緩沖物質(zhì)，被精子膜阻擋在細(xì)胞外，但其可以調(diào)節(jié)稀釋液中其他物質(zhì)的生物活性，有益于精液保存[13]。此外，卵黃作為一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和抗凍保護(hù)劑，能夠?yàn)榫拥拇x活動(dòng)提供能量，維持精子的活力、保證精子膜的穩(wěn)定性和完整性以及保護(hù)頂體的完整性[14-15]。卵黃中的高密度脂蛋白可以使精子膜中的膽固醇丟失，改變磷脂層的流動(dòng)性，增強(qiáng)精子對(duì)低溫打擊的敏感性。同時(shí)有報(bào)道稱尿道球腺產(chǎn)生的一種蛋黃凝固酶會(huì)與卵黃發(fā)生相互作用，不利于精液保存[16-17]。在稀釋液中添加卵黃存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)槁腰S是動(dòng)物源性的添加物質(zhì)，可能存在生物學(xué)感染，其中可能會(huì)含有病毒、毒素等[18-19]。卵黃來(lái)源的畜禽品種、飼養(yǎng)條件等差別較大，可能會(huì)存在性能不穩(wěn)定的情況。

表2 在常溫保存下不同濃度卵黃對(duì)湖羊精子活力的影響 %

表3 在常溫保存下不同濃度卵黃對(duì)湖羊精子運(yùn)動(dòng)性能的影響

目前，湖羊精液的液態(tài)保存已經(jīng)進(jìn)行了多方面的研究，目前湖羊精液研究較多的是低溫保存和超低溫冷凍保存，在常溫保存上鮮有報(bào)道[20-21]。相比于低溫保存，精液常溫保存對(duì)精子代謝和細(xì)菌的抑制性更低，低溫保存的精液其保存時(shí)間更長(zhǎng)[22-23]。相比于常溫保存，精液低溫保存的稀釋液配方和操作過(guò)程更為復(fù)雜，不利于推廣應(yīng)用，而且低溫保存可能會(huì)對(duì)精子膜產(chǎn)生一定影響，同時(shí)低溫保存也有可能引起受精能力的降低和胚胎丟失率的增加[24-26]。本研究結(jié)果表明，添加卵黃可以提高精液品質(zhì)，延長(zhǎng)有效存活時(shí)間和總存活時(shí)間，使精子活力、活率等緩慢下降，尤其在精液保存后期發(fā)揮了有益作用。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于卵黃在不同物種或者不同的精液保存方式中有較多報(bào)道。劉新峰等[27]在對(duì)驢精液常溫保存的研究中發(fā)現(xiàn)，15%卵黃添加量對(duì)精液的保存效果最好。Bispo等[28]在對(duì)山羊精液超低溫保存的研究中發(fā)現(xiàn)，2.5%的卵黃添加量對(duì)解凍后精液品質(zhì)最好。朱海鯨等[29]研究發(fā)現(xiàn)，添加13.5%卵黃時(shí)陜北白絨山羊精液冷凍保存效果最佳。胡傳水[30]研究發(fā)現(xiàn)，添加20%卵黃時(shí)豬精液常溫保存效果最佳。本實(shí)驗(yàn)中，雖然物種不同，采用的保存方式可能不同，但是添加卵黃提高了湖羊精液常溫保存過(guò)程中的精液品質(zhì)，延長(zhǎng)了精子的存活時(shí)間，使精液品質(zhì)緩慢改變，與上述研究結(jié)果相一致。楊燦鋒等[31]研究結(jié)果表明，稀釋液同時(shí)添加糖類和卵黃時(shí)，若卵黃添加量過(guò)大，會(huì)降低精液品質(zhì)。這一研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)中添加15%和20%卵黃降低了前期精子活力相一致。直線速率、曲線速率、路徑速率和側(cè)擺幅度指標(biāo)是描述精子速度的單個(gè)變量，與繁殖性能關(guān)系密切[32]。直線速率、曲線速率和路徑速率是評(píng)價(jià)精子運(yùn)動(dòng)性能的關(guān)鍵指標(biāo)，受精能力與其成正比[33]。Liu等[34]研究顯示，側(cè)擺幅度和鞭打頻率與精液品質(zhì)存在顯著關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)中直線速率、曲線速率、路徑速率和側(cè)擺幅度與精子活力呈正比，其他運(yùn)動(dòng)指標(biāo)與精子活力之間不存在相關(guān)關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)卵黃對(duì)湖羊精子具有雙重作用。在精液保存初期，低濃度卵黃可以提升精液品質(zhì)而高濃度卵黃降低了精液品質(zhì)，這可能是由于高濃度卵黃改變了精子的生存環(huán)境，使?jié)B透壓等條件發(fā)生改變[30,35]；在精液保存中后期，卵黃添加組都可以提升精液品質(zhì)，而高濃度的卵黃效果更好，這可能是在保存過(guò)程中隨著糖類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，卵黃逐漸為精子代謝活動(dòng)提供能量，進(jìn)而延長(zhǎng)了精液的保存時(shí)間，改善了精液品質(zhì)，也可能是由于卵黃中的卵磷脂和低密度脂蛋白黏附在精子膜表面，保護(hù)了膜的完整性，降低了隨著時(shí)間推移精液中產(chǎn)生的有害物質(zhì)（如代謝廢物、細(xì)菌以及一些活性氧對(duì)精子）的損害作用[36-37]。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度卵黃在常溫保存條件下在不同時(shí)間段對(duì)湖羊精液的保存效果不同。保存初期高濃度卵黃降低了精液品質(zhì)，但后期添加不同濃度卵黃均提高了精液品質(zhì)，延長(zhǎng)了精子存活時(shí)間。在保存144 h內(nèi)，添加5%卵黃對(duì)湖羊精液的常溫保存效果最好；保存144～216 h，添加15%卵黃對(duì)湖羊精液的常溫保存效果最好；保存216 h后，添加20% 卵黃對(duì)湖羊精液的常溫保存效果最好。