稀釋液和稀釋比例對(duì)番鴨精子活率、質(zhì)膜完整率和受精率的影響

段元彬，劉小林*，江中良，張慧林，陳 強(qiáng)

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西咸陽(yáng) 712100；2.陜西安大農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，陜西渭南 714300）

在人工授精前，通常需要用不同稀釋液對(duì)精液進(jìn)行一定比例的稀釋。Lake等[1]通過(guò)對(duì)雞精液的成分分析，首次配制了一種雞的精液稀釋液（Lake氏液）。谷氨酸鈉對(duì)精子的保護(hù)作用也被證實(shí)，檸檬酸鈉和檸檬酸鉀同樣能夠延長(zhǎng)精子保存時(shí)間[2]。楊保田等[3]研究發(fā)現(xiàn)檸檬酸鈉溶液能有效提高雞精子的生存指數(shù)。糖（葡萄糖、果糖）等能源物質(zhì)是精子在體外保存不可缺少的部分。蘇東頓等[4]研究證明果糖能提高精液的受精力。黃仁術(shù)[5]試驗(yàn)證明果糖保存精液的效果優(yōu)于葡糖糖和蔗糖。

番鴨作為優(yōu)良的瘦肉型鴨，具有生長(zhǎng)迅速、耐粗飼、產(chǎn)肝性能好等特點(diǎn)[6-7]。現(xiàn)代化番鴨養(yǎng)殖基地普遍采用人工授精結(jié)合籠養(yǎng)的飼養(yǎng)管理方式。人工授精在雞上的研究比較成熟，但在番鴨精液稀釋液配方上的進(jìn)展較少[8]，生理鹽水仍然是許多番鴨養(yǎng)殖企業(yè)的常用稀釋液，但其受精率低下；同時(shí)生產(chǎn)實(shí)踐中也常出現(xiàn)因精液采集過(guò)量而造成浪費(fèi)。本實(shí)驗(yàn)旨在研究常溫下不同稀釋液和稀釋比例對(duì)番鴨精子活率的影響，確定最佳稀釋液和稀釋比例，從而為番鴨人工授精技術(shù)提供指導(dǎo)，為番鴨人工授精前精液稀釋提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)選擇陜西省渭南市潼關(guān)縣留果安大番鴨養(yǎng)殖基地的40周齡黑羽公番鴨8羽和1 080羽產(chǎn)蛋期黑羽母番鴨。實(shí)驗(yàn)公鴨按飼養(yǎng)管理規(guī)程自由采食飲水，實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行為期1周的采精訓(xùn)練，每隔1 d采精1次。

1.2 試劑和儀器 葡萄糖、果糖、超純水、青霉素、鏈霉素等所有化學(xué)藥品均來(lái)自Solarbio。實(shí)驗(yàn)儀器包括顯微鏡、恒溫箱、水浴鍋、移液槍、采精杯、集精杯、1 mL注射器、容量瓶、計(jì)數(shù)器以及血細(xì)胞計(jì)數(shù)板等。

1.3 稀釋液配制 按配方配制NO-1稀釋液、NO-2稀釋液和BJJX稀釋液作為精液稀釋液，以生理鹽水作為對(duì)照，滅菌冷卻4℃冷藏備用。稀釋液成分見(jiàn)表1。

表1 稀釋液主要成分

1.4 精液采集 用于實(shí)驗(yàn)的種公番鴨在采精前剪掉泄殖腔周?chē)挠鹈?，以免影響采精，于?9:30左右采精。采用按摩和母鴨誘情結(jié)合法采集8羽40周齡的黑羽公番鴨精液，待種公番鴨勃起有射精反應(yīng)時(shí)，左手持采精杯，用右手按壓種公番鴨生殖器外的泄殖腔收集精液，同時(shí)注意防止血液、羽毛或糞便混入精液，隔天采集1次。

1.5 精液鑒定與處理 用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定每次采集精液的精子濃度和運(yùn)動(dòng)能力。選用優(yōu)質(zhì)精液（珍珠白，無(wú)泄殖腔產(chǎn)物污染，體積大于0.2 mL，精子活率大于0.7，精子濃度大于1×109精子/mL）。將精液分成4等份，用NO-1稀釋液、NO-2稀釋液、BJJX稀釋液和生理鹽水按精液∶稀釋液體積比1:1、1:2、2:1（v/v）分別稀釋于2 mL無(wú)菌離心管中，17℃恒溫箱恒溫保存。每隔8 h對(duì)各組精子活率進(jìn)行測(cè)定，直至精子全部死亡為止。本實(shí)驗(yàn)共持續(xù)2個(gè)月。

1.6 精子活率的評(píng)估 采用標(biāo)準(zhǔn)主觀評(píng)分法評(píng)估精子運(yùn)動(dòng)能力。將稀釋至2×108/mL精子濃度的1滴精液，滴加在預(yù)熱至37℃的載玻片和蓋玻片之間，并在400×顯微鏡下觀察。計(jì)量視野中前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子的比例，至少統(tǒng)計(jì)200個(gè)精子。所有的觀察分析都由同一個(gè)人完成。

1.7 精子質(zhì)膜完整性的評(píng)估 采用低滲腫脹試驗(yàn)評(píng)估質(zhì)膜完整性，質(zhì)膜完整精子表現(xiàn)為尾部彎曲或腫脹。低滲溶液為檸檬酸鈉0.735 g、果糖1.35 g、蒸餾水100 mL[9]。取10 μL稀釋精液和1 mL低滲溶液于離心管中，37℃孵育30 min，并在400×顯微鏡下觀察。每個(gè)載玻片至少觀察到200個(gè)精子，計(jì)數(shù)尾部彎曲腫脹精子數(shù)比例。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 人工授精 將采集自經(jīng)過(guò)選育的8羽優(yōu)良黑羽公番鴨的新鮮精液混合，分成4個(gè)等份；以NO-1、N0-2、BJJX、生理鹽水分別以精液:稀釋液體積比1:1稀釋?zhuān)陨睇}水為對(duì)照組，稀釋后馬上輸精。對(duì)同一批1 080只40周齡黑羽產(chǎn)蛋母番鴨進(jìn)行人工授精，于撿蛋后10:00左右輸精，每5 d輸精1次，每次輸精0.1 mL，單次采精輸精在1 h內(nèi)完成。授精后第2天收集合格種蛋。統(tǒng)計(jì)4組受精率并分析其差異，人工授精實(shí)驗(yàn)共持續(xù)3月左右。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析 用Excel 2019軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用ANOVA和Tukey's進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。所得結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 不同稀釋比例的稀釋液對(duì)精子活率的影響 經(jīng)測(cè)定，新鮮精液精子活率0.91。如表2所示，所有稀釋液組的精子活率都隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯下降。稀釋比例為1:1時(shí)，NO-1、NO-2、BJJX組精子活率于24 h出現(xiàn)明顯下降，對(duì)照組于16 h后出現(xiàn)顯著下降；稀釋比例為1:2時(shí)，NO-1、BJJX組精子活率于24 h出現(xiàn)明顯下降，2組在8 h，對(duì)照組于16 h后出現(xiàn)顯著下降；稀釋比例為2:1時(shí)，NO-1、NO-2、BJJX、對(duì)照組精子活率于16 h明顯下降。3種稀釋比例下精液以NO-1稀釋液稀釋保存24 h，精子活率過(guò)低，不適于輸精；精液以NO-2稀釋液在1:1和2:1比例下稀釋保存16 h后不適于輸精，1:2比例下8 h不適用輸精；BJJX在16 h不適于受精；生理鹽水在1:1～1:2比例下保存16 h，在2:1比例保存8 h后不適用于輸精。

結(jié)果顯示，保存后期，實(shí)驗(yàn)組精子活率高于生理鹽水組，精子受精能力的維持時(shí)間更長(zhǎng)。

表2 稀釋液類(lèi)型和稀釋比例對(duì)精子活率的影響

2.2 不同稀釋比例的稀釋液對(duì)精子質(zhì)膜完整率的影響經(jīng)測(cè)定，新鮮精液質(zhì)膜完整率0.92。由表3可見(jiàn)，在3個(gè)稀釋比例下，各組質(zhì)膜完整率都隨保存時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷下降。各組的精子質(zhì)膜完整率差異不顯著。

2.3 NO-1、NO-2和BJJX 3種稀釋液對(duì)受精率的影響由表4可見(jiàn)，與生理鹽水相比，3種稀釋液受精率均極顯著提高。NO-1稀釋液的受精率最高，極顯著高于NO-2稀釋液，同時(shí)NO-1和BJJX組種蛋合格率顯著高于生理鹽水對(duì)照組。

表4 稀釋液對(duì)受精率的影響 %

3 討論

3.1 稀釋比例對(duì)精子活率的影響 精子活率是評(píng)價(jià)精子授精潛力的重要指標(biāo)。精液稀釋比例對(duì)保存期間的精子活率具有很大影響。精液稀釋可以大幅提高番鴨精液利用率，充分發(fā)揮公鴨的繁殖潛力，降低精漿中精子的粘滯性，防止精子的提前活化。本實(shí)驗(yàn)中相比于1:1和1:2比例，稀釋比例為2:1時(shí)，保存后期精子活率更低。這主要是由于較低的稀釋比例往往造成精漿-稀釋液中精子密度過(guò)大，精子代謝產(chǎn)物積累過(guò)快[10]，同時(shí)會(huì)造成精漿-稀釋液中能源物質(zhì)如糖的快速消耗，造成精子保存時(shí)間短，不利于精子運(yùn)動(dòng)能力的長(zhǎng)久保持。本實(shí)驗(yàn)中，NO-2組精液隨稀釋比例的增大而表現(xiàn)出保存質(zhì)量的下降，隨精子稀釋比例的增大，精漿中糖類(lèi)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及緩沖物質(zhì)濃度會(huì)隨之下降[11-12]，對(duì)精子的保護(hù)緩沖作用降低。稀釋液添加會(huì)通過(guò)改變精子密度從而明顯影響精液保存質(zhì)量，包括精子活率和質(zhì)膜完整率[13-14]。因此，具體稀釋比例需要根據(jù)鮮精精子活率和精子密度而決定。

本實(shí)驗(yàn)中，在各個(gè)稀釋比例下，NO-1與BJJX稀釋液的精子活率高于NO-2和生理鹽水，這與NO-1與BJJX中高含量的單糖有關(guān)，較高含量的糖保證保存期間精子的代謝消耗，延長(zhǎng)精子保存時(shí)間。

3.2 稀釋液對(duì)精子活率和受精率的影響 稀釋液的稀釋效果與稀釋液組分密切相關(guān)[15]。合理的稀釋液配方對(duì)精漿-稀釋液中精子運(yùn)動(dòng)能力的維持、形態(tài)穩(wěn)定以及精子代謝的正常進(jìn)行具有非常重要的作用[16-17]。本研究中，在相同稀釋比例下，NO-1稀釋液較其余3組精子活率更高，這與NO-1稀釋液組分有關(guān)。有研究表明，相同稀釋介質(zhì)下果糖的稀釋效果要優(yōu)于葡萄糖[18]；高含量的谷氨酸鈉則為精子膜的完整性提供保障，延緩精子膜的損傷性變化，降低精子畸形的發(fā)生[19]；同時(shí)Tris的添加有效緩沖了因精子代謝造成的精漿-稀釋液理化性的惡化（如pH下降）[20]，對(duì)精液保存起到有效的緩沖作用。NO-2稀釋液的精子活率低于BJJX稀釋液，可能是由于NO-2稀釋液組分中單糖含量過(guò)低，單糖作為能源物質(zhì)是稀釋液的重要組分，單糖含量太少，不足以支撐精子細(xì)胞長(zhǎng)期代謝的能量消耗。

保證單位體積精漿-稀釋液中含有足夠的活性精子數(shù)可獲得更高的受精率，因此在相同比例下，更高精子活率、更長(zhǎng)保存時(shí)間的NO-1稀釋液表現(xiàn)為更高的受精率。

3.3 稀釋液和稀釋比例對(duì)質(zhì)膜完整性的影響 精子質(zhì)膜作為精子細(xì)胞與外界環(huán)境的屏障，控制精子與外界環(huán)境的物質(zhì)交換，也是保存期間精子細(xì)胞最容易遭受損傷的部位。因此，檢測(cè)評(píng)估保存期間的精子膜完整性具有非常重要的意義。本實(shí)驗(yàn)中，各組精子質(zhì)膜完整率均隨保存時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。精液保存過(guò)程中，精漿中精子代謝產(chǎn)物不斷積累，使精子保存環(huán)境的理化性質(zhì)惡化，以及精漿中活性氧的積累均會(huì)對(duì)精子膜造成損傷，從而最終導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組精子質(zhì)膜完整性的不斷下降。此外，糖尤其是果糖作為能量和必需氨基酸的重要來(lái)源，在精子細(xì)胞膜破裂損傷過(guò)程中起著重要的作用[21]。而隨著稀釋液中單糖不斷消耗，導(dǎo)致保存后期稀釋液的保護(hù)作用降低，精子膜損傷增加。各實(shí)驗(yàn)組之間質(zhì)膜完整性差異不顯著，可能是由于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組滲透壓與精子細(xì)胞接近等滲。

4 結(jié)論

稀釋液的稀釋效果與稀釋比例以及稀釋液本身的組分有很大關(guān)系。番鴨精液在保存或授精前應(yīng)選用恰當(dāng)配方的稀釋液適當(dāng)稀釋?zhuān)号c稀釋比例適宜在1:1～1:2。本實(shí)驗(yàn)中NO-1稀釋液是番鴨精液人工授精稀釋和在17℃下短期保存的最佳稀釋液，通過(guò)提供精子外源能量和保證精子能量代謝所必需的適宜環(huán)境，延長(zhǎng)精子保存時(shí)間。