延邊半細(xì)毛羊羊毛細(xì)度測定及其CD200 基因克隆與表達(dá)分析

劉曉軍，關(guān)喜東，于 寧，姜 楠，張立春，孫福亮*

（1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133000；2.圖們市農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)局，吉林圖們 133100；3.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧分院，吉林公主嶺 136100）

延邊半細(xì)毛羊是延邊地區(qū)特有的品種，是以當(dāng)?shù)仉s種羊?yàn)槟副荆钥剂Υ驗(yàn)楦副?，通過逐級(jí)雜交選育出的品系[1]。近年來養(yǎng)殖戶又引進(jìn)德國美利奴種羊，與延邊半細(xì)毛羊母羊進(jìn)行雜交，以進(jìn)一步提升延邊半細(xì)毛羊的羊毛品質(zhì)及肉品質(zhì)，但未有研究對(duì)新雜交后的延邊半細(xì)毛羊羊毛細(xì)度進(jìn)行過測定。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)新改良后的延邊半細(xì)毛羊的羊毛細(xì)度進(jìn)行檢測，為延邊半細(xì)毛羊的育種提供數(shù)據(jù)參考。

近年來，隨著毛紡產(chǎn)品向輕薄、柔軟、挺括、高檔方向發(fā)展，國內(nèi)外學(xué)者加強(qiáng)了對(duì)羊毛細(xì)度相關(guān)基因的研究[2-3]，如王小佳等[4]研究表明BMPR1B基因的mRNA表達(dá)量與羊毛細(xì)度呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.382；張文建等[5]鑒定出中國美利奴羊CCNY基因的3個(gè)SNP位點(diǎn)與羊毛細(xì)度顯著相關(guān)；Zhang等[6]通過RNA-seq分析得到CD200在毛纖維直徑差異顯著的小尾寒羊和新吉細(xì)毛羊皮膚中表達(dá)量差異顯著。

CD200基因又稱MRC OX2，由McMaster等[7]于1979年發(fā)現(xiàn)，是一種細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白，與其受體CD200R均屬于免疫球蛋白超家族。CD200在胸腺、神經(jīng)系統(tǒng)、血管內(nèi)皮、滋養(yǎng)層、子宮、免疫系統(tǒng)等組織中廣泛表達(dá)。有研究報(bào)道CD200-CD200R相互作用能減弱炎癥反應(yīng)，提高免疫耐受性，降低器官移植的排斥反應(yīng)等[8-11]。近年來研究發(fā)現(xiàn)CD200也與動(dòng)物毛發(fā)的發(fā)育密切相關(guān)，如Rosenblum等[12]研究發(fā)現(xiàn)CD200基因在小鼠毛囊外根鞘的角質(zhì)形成細(xì)胞上表達(dá)；CD200在人的毛囊中亦有表達(dá)，并且與毛囊干細(xì)胞標(biāo)記物有關(guān)，進(jìn)而成為鑒定、分選毛囊干細(xì)胞的重要標(biāo)識(shí)[13]；CD200也作為羊毛囊干細(xì)胞的標(biāo)記基因而用于篩選毛囊干細(xì)胞[14]，但國內(nèi)外尚未報(bào)道CD200在綿羊羊毛品質(zhì)方面的研究。因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)延邊半細(xì)毛羊皮膚毛囊中CD200基因進(jìn)行克隆與定位來探討其與羊毛細(xì)度的相關(guān)性，為延邊半細(xì)毛羊群體的育種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與樣品采集 本實(shí)驗(yàn)從龍井市某養(yǎng)殖場選擇在相同條件下飼養(yǎng)的體重相近的10月齡雌性延邊半細(xì)毛羊20只，對(duì)其肩胛部進(jìn)行剪毛，并收集毛樣；將剪過毛的皮膚用75%的酒精消毒后，剪取1 cm× 1 cm皮膚組織放入4%多聚甲醛溶液中固定，再剪取100 mg左右組織皮膚放入液氮中冷凍保存。

1.2 主要試劑 Trizol試劑盒購自Invitrogen公司；DNA Marker、DNA膠回收試劑盒、pMD19-T載體、RNasefreeDNase Ⅰ及大腸桿菌 DH5α均購自于寶生物工程（大連）有限公司；DNA質(zhì)粒提取試劑盒與反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于廣州飛翔生物工程有限公司，免疫組化試劑盒購自上海生工生物股份有限公司。

1.3 羊毛細(xì)度測定 羊毛經(jīng)過乙醚洗滌處理后，切取距離毛根2/3處的斷面在羊毛測定儀檢測羊毛直徑。將測得的數(shù)據(jù)用SPSS軟件求平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，再根據(jù)《綿羊毛》（GB 1523—2013）國標(biāo)細(xì)度來判定改良后的延邊半細(xì)毛羊的羊毛細(xì)度。

1.4 免疫組化實(shí)驗(yàn) 取固定好的皮膚組織進(jìn)行脫水、包埋、切片后，將 4 μm厚的切片在烤片機(jī)上65℃烘烤1 h，后續(xù)步驟參照免疫組化試劑盒進(jìn)行操作。

1.5 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上的序列（登錄號(hào)：XM_012190412）與Oligo7.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列為F：5'-CGCGGATTCATGTTATGCAGGGCACAAGTG-3'，R：5'-CCCAAGCTTCTAGGGCTCTCGATCTTGGT T-3'，引物由上海捷瑞生物有限公司合成。

1.6 RNA提取及cDNA合成 用Trizol法提取皮膚總RNA：稱重100 mg皮膚組織樣品，放入預(yù)冷的研缽中研磨，研磨成粉末后轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，后續(xù)步驟按Trizol說明書進(jìn)行，提取出的RNA用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。以皮膚中總RNA為模板，通過RT-PCR反應(yīng)合成cDNA第一鏈，反應(yīng)步驟參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作。

1.7 PCR擴(kuò)增 以CD200基因的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)體系為20.0 μL：10×Buffer 2.5 μL，dNTP 0.5 μL，0.3 μmol/L的上下游引物各0.5 μL，cDNA 1.0 μL，Taq酶0.3 μL，ddH2O 11.7 μL，MgCl23 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，69℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72℃再延伸15 min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.8CD200克隆 用膠回收試劑盒回收目的片段，取純化的PCR回收產(chǎn)物與MD19-T載體混勻后在4℃條件下過夜，再將質(zhì)粒pMD19-T-CD200轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂于氨芐抗性的固體LB平板，37℃條件下培養(yǎng)12～16 h。經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，接種到氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基37℃繼續(xù)培養(yǎng)12 h，用DNA質(zhì)粒提取試劑盒提取菌液中的質(zhì)粒，對(duì)重組質(zhì)粒用PCR鑒定，陽性結(jié)果送至上海生工生物股份有限公司測序。

1.9 生物信息學(xué)分析 用 EditSeq（DNAStar）對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行分析，通過MegAlign（DNAStar）軟件對(duì)延邊半細(xì)毛羊和綿羊（登錄號(hào)：XM_004002915）、山羊（登錄號(hào)：XM_018065460）、牛（登錄號(hào)：XM_024990382）、野豬（登錄號(hào)：XM_021070383）、貓（登錄號(hào)：XM_023260131）、人（登錄號(hào)：NM_005944）、小鼠（登錄號(hào)：XM_017316889）進(jìn)行CD200基因序列的同源性分析，并構(gòu)建基因進(jìn)化樹；采用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）工具對(duì)綿羊CD200基因編碼蛋白基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析，用在線GOR4工具與Protean（DNAStar）對(duì)CD200蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測及分析，進(jìn)一步利用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasyorg/）預(yù)測三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 羊毛細(xì)度分析 羊毛纖維直徑為（19.26±2.69）μm（為66支左右），已達(dá)到細(xì)毛羊的細(xì)度，說明用德國美利奴羊改良后延邊半細(xì)毛羊羊毛品質(zhì)顯著提高。

2.2 免疫組化實(shí)驗(yàn) 經(jīng)免疫組化染色后發(fā)現(xiàn)（圖1），CD200基因在毛囊的外根鞘、毛囊干細(xì)胞及表皮層位置表達(dá)。因此，通過檢測CD200在皮膚毛囊中的表達(dá)部位，對(duì)其在皮膚毛囊中的作用研究奠定理論基礎(chǔ)。

2.3 綿羊CD200基因PCR擴(kuò)增與鑒定 提取組織中的總RNA，以皮膚中的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果顯示，成功擴(kuò)增出了延邊半細(xì)毛羊CD200基因，大小約為729 bp，與目的條帶一致（圖2）。對(duì)重組質(zhì)粒pMD19T-CD200進(jìn)行PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)在約729 bp處出現(xiàn)1條特異性條帶，與CD200基因大小相符（圖3），表明獲得了重組表達(dá)質(zhì)粒pMD19T-CD200。

2.4 序列分析及同源性比對(duì) 測序結(jié)果全長為729 bp，將測序結(jié)果用Seqmen軟件進(jìn)行拼接，經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫（登錄號(hào)XM_012190412）Blast N比對(duì)鑒定，克隆的CD200基因片段大小與原始基因一致，顯示該片段CDS區(qū)長為729 bp，比對(duì)后發(fā)現(xiàn)存在2個(gè)SNP位點(diǎn)，同源性為99.7%。對(duì)各物種的同源性分析結(jié)果顯示延邊細(xì)半毛羊的CD200基因與綿羊、山羊、牛、貓、人、野豬、小鼠的同源性分別為99.7%、99.5%、97.6%、88.4%、85.0%、81.9%、79.3%，說明各物種間同源性相對(duì)較高，但隨著物種進(jìn)化距離的增加，CD200基因也相應(yīng)表現(xiàn)出同源性降低的現(xiàn)象。

2.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 如圖4所示，延邊半細(xì)毛羊CD200基因與綿羊的親緣關(guān)系最近，與鼠的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，在同一物種間及不同物種間比較分析得出該基因在生物進(jìn)化中比較保守。

2.6 理化性質(zhì)分析 將測序結(jié)果用Edit Seq分析得出該基因長度為729 bp，編碼242個(gè)氨基酸，1個(gè)終止密碼子不編碼氨基酸，氨基酸序列見圖5，用Megalign（DNAStar）對(duì)克隆到的延邊半細(xì)毛羊基因和XM_012190412所編碼的氨基酸殘基進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)第193個(gè)氨基酸殘基不同，由G變?yōu)镽，說明該位點(diǎn)基因突變屬于錯(cuò)義突變，第117個(gè)氨基酸殘基沒有改變，說明編碼此處的基因突變屬于沉默突變。延邊半細(xì)毛羊CD200蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，該蛋白的相對(duì)分子量為26.97 ku，分子式為C1212H1941N323O349S11，理論等電點(diǎn)為8.82，親水性為0.086，不穩(wěn)定系數(shù)為36.73，表明該蛋白為穩(wěn)定的堿性疏水性蛋白。

2.7 蛋白親水性分析 當(dāng)親水性的值大于零時(shí)，蛋白為疏水性蛋白，反之則為親水性蛋白。經(jīng)預(yù)測CD200蛋白存在較多疏水性區(qū)域，與采用ProtParam工具分析所得的結(jié)果一致，為疏水性蛋白。說明水相中CD200蛋白內(nèi)部帶有非極性側(cè)鏈的氨基酸形成的疏水區(qū)域較大，從而引起熵的降低及蛋白折疊程度的增大。

2.8 二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測 預(yù)測到CD200蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)包括α螺旋、延伸鏈、無規(guī)則卷曲構(gòu)成（圖6），其中無規(guī)則卷曲135個(gè)，占二級(jí)結(jié)構(gòu)的55.79%，結(jié)合蛋白的骨架柔性分析，說明CD200蛋白易發(fā)生扭曲及折疊。

CD200蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果表明，CD200蛋白的空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜，是由多個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)緊密纏繞形成的球狀結(jié)構(gòu)（圖7）。

3 討論

近年來世界羊毛品質(zhì)出現(xiàn)了劃時(shí)代的變革，主要表現(xiàn)在羊毛細(xì)度方面。如澳大利亞是世界羊毛產(chǎn)量最多的國家，最近幾年其羊毛總產(chǎn)量雖有減少，但平均直徑小于19 μm的細(xì)羊毛產(chǎn)量大幅增加，我國也正用基因調(diào)控、引進(jìn)超細(xì)型種羊進(jìn)行雜交等方式提升羊毛細(xì)度，說明細(xì)毛羊養(yǎng)殖正在變革羊毛品質(zhì)的發(fā)展[15-16]。《綿羊毛》（GB 1523—2013）國家標(biāo)準(zhǔn)中將羊毛細(xì)度在66支（直徑小于25.0 μm）以上的羊品種定位為細(xì)毛羊類，經(jīng)檢測延邊半細(xì)毛羊的羊毛平均直徑為（19.26±2.69）μm，對(duì)比澳洲羊毛和國標(biāo)說明延邊半細(xì)毛羊品系具有良好的羊毛細(xì)度，且在纖維細(xì)度方面有穩(wěn)定的遺傳。

羊毛的細(xì)度、長度、彎曲度等性狀早在毛囊時(shí)期就已經(jīng)決定，因此要調(diào)控羊毛的性狀應(yīng)對(duì)毛囊的形成及機(jī)理進(jìn)行調(diào)控分析，但羊毛的組成成分復(fù)雜，羊毛形成不僅受角蛋白中間絲（Keratin Intermediate Filament，KRTIF）和角蛋白輔助蛋白（Keratin-associated proteins，KAPs）這兩個(gè)家族中的多個(gè)基因聯(lián)合表達(dá)的影響，也受Sox9、Lhx2、Tcf3/4、Nfatc1、Gab1、CD200等多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的周期性調(diào)控[17]。乃門塔娜[18]研究證明干擾Sox9表達(dá)后的毛囊干細(xì)胞無法完成從S期到G2/M期的過渡；?zlem等[19]研究發(fā)現(xiàn)Gab1和Mapk信號(hào)在頭發(fā)周期和毛囊干細(xì)胞靜止過程中起著至關(guān)重要的作用；Zhang等[6]通過RNAseq分析出CD200為小尾寒羊和新吉細(xì)毛羊的差異基因，其在毛纖維較粗的小尾寒羊皮膚中表達(dá)極低，在新吉細(xì)毛羊皮膚中表達(dá)高；本研究中延邊半細(xì)毛羊的羊毛細(xì)度較細(xì)，接近新吉細(xì)毛羊的細(xì)度，而且也成功地從其皮膚中克隆出了CD200基因，且定位在皮膚毛囊部位表達(dá)，與李東江等[20]報(bào)道的毛細(xì)度較粗的云南半細(xì)毛羊皮膚中未檢測到CD200基因的結(jié)論一致，進(jìn)而說明CD200基因在細(xì)毛羊中表達(dá)較高，而在半細(xì)毛羊或粗毛羊中表達(dá)低或不表達(dá)。因此，推測CD200基因是引起羊毛細(xì)度的差異基因，可能對(duì)羊毛細(xì)度起調(diào)控作用。

本實(shí)驗(yàn)采用酶標(biāo)抗體法檢測到CD200在毛囊的外根鞘、毛囊干細(xì)胞及表皮層表達(dá)，與Rosenblum[11]檢測的CD200基因在小鼠皮膚的表皮層、外根鞘及毛囊干細(xì)胞中表達(dá)一致。Sanja等[21]研究發(fā)現(xiàn)CD200能維持和更新角膜緣表皮細(xì)胞，因此可推測綿羊表皮高表達(dá)的CD200基因也可能參與到皮膚表皮細(xì)胞的維持和更新，CD200在毛囊干細(xì)胞與外根鞘表達(dá)推測該基因可能參與毛囊周期性的發(fā)育及毛發(fā)性狀的調(diào)控，但有待進(jìn)一步證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)延邊半細(xì)毛羊CD200基因與其他物種比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該基因在物種進(jìn)化過程中比較保守，且能穩(wěn)定遺傳；通過對(duì)CD200蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測，為深入研究綿羊的CD200蛋白提供基本的數(shù)據(jù)資料，也為CD200調(diào)控羊毛細(xì)度表達(dá)作用機(jī)理的研究奠定理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，延邊半細(xì)羊毛的羊毛細(xì)度符合國家細(xì)毛羊標(biāo)準(zhǔn)。通過免疫組化得知CD200基因在延邊半細(xì)毛羊皮膚的表皮層、外根鞘及毛囊干細(xì)胞表達(dá)；通過克隆分析表明CD200可能參與調(diào)控羊毛細(xì)度的表達(dá)。