貴州白山羊ADIPOQ 基因生物信息及組織表達(dá)特異性分析

安清明 ，王 星，黃永震，孟金柱，趙園園，田秀珍，吳震洋*

（1.銅仁學(xué)院農(nóng)林工程與規(guī)劃學(xué)院，貴州銅仁 554300；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100；3.華珍牧業(yè)有限公司，貴州銅仁 554300）

脂肪組織能分泌一類(lèi)具有生物活性的脂肪因子從而調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝，因此在機(jī)體能量?jī)?chǔ)存、脂肪酸代謝和糖類(lèi)代謝中扮演十分重要的角色。脂聯(lián)素（Adiponectin，ADIPOQ、APM1或Acrp30）是一種由脂肪細(xì)胞分泌的脂肪因子，由4個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，分別為信號(hào)肽區(qū)、可變區(qū)、N-膠原蛋白三螺旋區(qū)域和C-球狀區(qū)域[1-2]。脂聯(lián)素由Adiponectin（ADIPOQ）基因編碼，該基因包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。脂聯(lián)素主要通過(guò)結(jié)合其他蛋白從而協(xié)同調(diào)節(jié)特殊的生理功能，如脂聯(lián)素能通過(guò)相關(guān)結(jié)合蛋白直接參與調(diào)節(jié)AMP激酶與PPAR配體活性，并且間接調(diào)節(jié)脂肪酸氧化和糖類(lèi)攝取[3]。ADIPOQ在不同人群中已被標(biāo)記與機(jī)體肥胖、胰島素耐受性、糖尿病等重要性狀具有關(guān)聯(lián)性[4]，且是目前為止發(fā)現(xiàn)不多的一種由脂肪組織分泌并與肥胖呈負(fù)相關(guān)的調(diào)節(jié)因子。ADIPOQ基因遺傳變異對(duì)家畜生產(chǎn)性能具有一定影響，如該基因的核苷酸變異對(duì)豬的胴體性狀及肉質(zhì)[5]、豬肩部脂肪量[6]、牛眼肌面積、牛背膘厚度、牛胴體性狀均有顯著影響[7-8]；而在山羊中ADIPOQ基因的研究較少，目前僅發(fā)現(xiàn)954G/A位點(diǎn)突變與山羊產(chǎn)羔數(shù)有一定關(guān)聯(lián)性[9]。

貴州白山羊是中國(guó)著名的白山羊品種之一，主要分布在黔東南、黔東北等地區(qū)，存欄量100多萬(wàn)只，為貴州目前群體數(shù)量最大的白山羊品種，是發(fā)展貴州畜牧業(yè)的重要種質(zhì)資源。貴州白山羊具有性成熟早、繁殖力強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)等特性，但存在個(gè)體較小、生長(zhǎng)速度慢、產(chǎn)肉量少等缺點(diǎn)?；贏DIPOQ基因在家畜動(dòng)物脂肪累積中的重要特性，本研究擬通過(guò)對(duì)貴州白山羊ADIPOQ基因全長(zhǎng)CDS區(qū)序列的生物信息、系統(tǒng)進(jìn)化及組織表達(dá)進(jìn)行分析，進(jìn)一步增進(jìn)對(duì)貴州白山羊的遺傳多樣性、發(fā)育情況和起源進(jìn)化的了解，以期為貴州白山羊遺傳資源的保護(hù)和利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 于2019年6月在貴州省銅仁市沿河土家族自治縣選取8只（公、母各4只）健康的1周歲齡貴州白山羊，屠宰后用FTA卡采集貴州白山羊血液，同時(shí)采集新鮮的心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟組織，DEPC沖洗干凈后用錫箔紙包裝迅速置于液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 Tris堿、乙二胺四乙酸、氫氧化鈉、TE緩沖液（實(shí)驗(yàn)室自備）、PCR Mix、DNA Marker、核酸染料GoldView、瓊脂糖等均購(gòu)自上海大山生物科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中山羊ADIPOQ基因序列（登錄號(hào)：NC_019458.2），利用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)5對(duì)基因外顯子特異性引物（表1），擴(kuò)增ADIPOQ基因所有3個(gè)外顯子的核苷酸序列，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 PCR引物信息

1.4 DNA提取 本研究用FTA卡采集貴州白山羊血液，常溫保存。采用“兩步法”提取基因組DNA[10]。從FTA上打孔取樣（孔徑1.2 mm）置于PCR管中，加入200 μL 20 mmol/L NaOH溶液，60℃加熱20 min至FTA變?yōu)榘咨?，吸凈NaOH液體，再加入200 μL 1×TE溶液，室溫靜置5 min，吸凈TE液體，自然晾干后用于PCR擴(kuò)增。

1.5 PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)體系20 μL：含血樣1.2 mm的FTA卡圓片1個(gè)，Taq PCR Master Mis試劑11 μL，10 mmol/L上下游混合引物1 μL，加ddH2O至20 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s，37個(gè)循環(huán)，延伸7 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察電泳結(jié)果。

PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果應(yīng)用DNAStar軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，并與NCBI中序列進(jìn)行對(duì)比。

1.6 生物信息學(xué)分析 利用ExPASY中的ProtParam程序預(yù)測(cè)ADIPOQ基因編碼氨基酸序列的理化性質(zhì)（http://expasy.org/tools/protparam.htmL），利用Protscale（http://web.expasy.org/protscale/）分析蛋白質(zhì)親疏水性；利用TMHMM（http://genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)；利用在線工具SignalP4.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/）分析蛋白潛在信號(hào)肽剪切位點(diǎn)；利用TargetP（http://cbs.dtu.dk/services/TargetP/）、PSORTII Prediction（https://psort.hgc.jp/form2.html）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位；利用Smart（http://smart.embl-heidelberg.de/）分析預(yù)測(cè)氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域；利用NetPhos 3.1 Server在線工具（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預(yù)測(cè)貴州白山羊ADIPOQ蛋白的磷酸化位點(diǎn)；通過(guò)STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/）分析蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)；利用IBCP（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL（https://www.swissmodel.expasy.org/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用DNAStar軟件分析其同源性及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.7 組織表達(dá)分析 采用Trizol法提取貴州白山羊各組織（心、肝、脾、肺和腎）總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金）將提取到的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，設(shè)計(jì)ADIPOQ基因特異性引物（表2），以GAPDH為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)[11]，按照RT-qPCR說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)配制反應(yīng)體系并設(shè)定反應(yīng)程序，反應(yīng)體系10 μL：SYBR premix Dimer Eraser（2℃）5 μL，上、下引物（10 pmol/mL）各0.4 μL，無(wú)菌去離子水3.2 μL，cDNA（20 ng/μL）1 μL。定量程序：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 5 s，55 ℃30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。采用RT-qPCR方法分析ADIPOQ基因mRNA在白山羊心、肝、脾、肺和腎臟中的表達(dá)情況。熒光定量實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)重復(fù)，采用2-△△CT方法對(duì)定量數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，利用Minitab16.0進(jìn)行顯著性差異分析。

表2 RT-qPCR引物信息及擴(kuò)增條件

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增 貴州白山羊ADIPOQ基因3個(gè)外顯子，經(jīng)5對(duì)引物P1～ P5擴(kuò)增后片段均為400 bp左右，與預(yù)期目標(biāo)一致，目的片段無(wú)雜帶，特異性較好，可用于下一步測(cè)序，結(jié)果見(jiàn)圖1。利用DNAStar軟件將5段序列進(jìn)行拼接比對(duì)，獲得貴州白山羊ADIPOQ基因CDS區(qū)序列全長(zhǎng)為720 bp的序列，共編碼239個(gè)氨基酸。

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 貴州白山羊ADIPOQ蛋白的理化性質(zhì)分析 利用ExPASY在線服務(wù)器對(duì)貴州白山羊ADIPOQ蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果如表3所示，貴州白山羊ADIPOQ蛋白由20種239個(gè)氨基酸組成，該蛋白分子式C1169H1774N314O348S5，相對(duì)分子質(zhì)量為25 955.14 ku，理論等電點(diǎn)為5.96，說(shuō)明該蛋白為酸性蛋白質(zhì)，蛋白正、負(fù)電荷氨基酸殘基總數(shù)分別為19、24個(gè)，半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為29.30，脂肪總數(shù)為75.40，總平均親水性（GRAVY）為-0.408。

2.2.2 疏水性、親水性分析 利用ExPASY在線服務(wù)器對(duì)貴州白山羊ADIPOQ蛋白氨基酸序列的親水性進(jìn)行分析，結(jié)果表明第7位氨基酸疏水值最大（3.111，正值），第136位氨基酸親水值最?。?2.633，負(fù)值），由圖2可知，整個(gè)多肽鏈親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，說(shuō)明ADIPOQ蛋白整個(gè)多肽鏈表現(xiàn)為親水性。

2.2.3 跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè) 利用TMHMM在線跨膜運(yùn)輸分析軟件預(yù)測(cè)ADIPOQ蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明ADIPOQ蛋白無(wú)跨膜區(qū)域，說(shuō)明其不屬于跨膜蛋白或不能定位于細(xì)胞膜上。

表3 貴州白山羊ADIPOQ蛋白氨基酸組成

2.2.4 潛在信號(hào)肽剪切位點(diǎn)預(yù)測(cè) 利用在線工具SignalP4.0在線預(yù)測(cè)ADIPOQ蛋白的N端信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，ADIPOQ蛋白1～17位為信號(hào)肽區(qū)域，第18位為潛在信號(hào)肽剪切位點(diǎn)，18位氨基酸以后為成熟蛋白區(qū)，表明該蛋白為分泌蛋白。

2.2.5 亞細(xì)胞定位 利用TargetP分析貴州白山羊ADIPOQ蛋白的亞細(xì)胞定位情況，利用PSORTII Prediction在線軟件進(jìn)行確證，結(jié)果表明，ADIPOQ蛋白屬于分泌蛋白，且其在胞外、分泌系統(tǒng)囊泡和線粒體中的分布比例分別是66.7%、22.2%和11.1%，在胞外分布最多（表4）。

表4 TargetP預(yù)測(cè)ADIPOQ亞細(xì)胞定位

2.2.6 ADIPOQ蛋白結(jié)構(gòu)域分析 由圖3可知，ADIPOQ蛋白1～17位氨基酸為Signal peptide結(jié)構(gòu)域，75～95位氨基酸為L(zhǎng)ow Complexity結(jié)構(gòu)域，101～237位氨基酸為C1Q保守結(jié)構(gòu)域。

2.2.7 ADIPOQ蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過(guò)NetPhos 3.1 Server在線工具預(yù)測(cè)貴州白山羊ADIPOQ蛋白的磷酸化位點(diǎn)，當(dāng)潛在的磷酸化位點(diǎn)的閾值為0.5時(shí)，貴州白山羊ADIPOQ蛋白存在多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，但只有8個(gè)蘇氨酸、4個(gè)絲氨酸和4個(gè)酪氨酸的磷酸化能力超過(guò)了閾值，表明貴州白山羊ADIPOQ蛋白存在16個(gè)潛在的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，在貴州白山羊ADIPOQ蛋白上可能有CDK5、p38MAPK、GSK、unsp、CKI2、cdc2、PKC、PKG、IGFR、PKA這10種保守的蛋白激酶結(jié)合位點(diǎn)，且在56處unsp得分最高，為0.988。

2.2.8 ADIPOQ蛋白與其他蛋白信息互作分析 通過(guò)STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)搜索與貴州白山羊ADIPOQ蛋白相互作用信息，選取與山羊物種親緣關(guān)系最近的牛為參考生物，置信度設(shè)置為最高值0.900，交互樹(shù)參數(shù)設(shè)置為10個(gè)以內(nèi)，以此構(gòu)建山羊ADIPOQ蛋白與其他蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖4），結(jié)果表明，ADIPOQ蛋白共與10蛋白存在互作效應(yīng)，且與ADIPOR1、ADIPIR2、CDH13和LEP蛋白之間的互作效應(yīng)最高。

2.2.9 ADIPOQ蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 程序分析表明，貴州白山羊ADIPOQ蛋白中，α-螺旋（Alpha helix，h）占9.62%；無(wú)規(guī)則卷曲（Random coil，c）占66.11%；延伸鏈（Extended strand，e）占24.27%（圖5），由此推測(cè)，無(wú)規(guī)則卷曲是ADIPOQ蛋白的主要結(jié)構(gòu)原件，延伸鏈散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中。由圖6可知，ADIPOQ蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲所占比例最高，其次為延伸鏈，與其二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相一致。

2.2.10 貴州白山羊ADIPOQ基因編碼蛋白同源性及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) 利用MegAlign軟件對(duì)山羊（本研究結(jié)果）、綿羊（NC_019458.2）、牦牛（NW_005396942.1）、普通牛（NC_037328.1）、馬（NC_009162.3）、獼猴（NC_027894.1）、家鼠（NC_000082.6）、大鼠（NC_005110.4）、豬（NC_010455.5）、雞（NC_006096.5）和人（NC_0000 03.12）的ADIPOQ基因編碼蛋白進(jìn)行同源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（表5、圖7）。結(jié)果表明，貴州白山羊ADIPOQ基因編碼蛋白序列與綿羊的同源性最高，為99.2%，與其他物種同源性依次為牦牛（95.0%）、普通牛（94.6%）、野豬（84.5%）、馬（84.0%）、獼猴（83.6%）、人（82.4%）、家鼠（81.6%）、大鼠（78.7%）和雞（66.1%）。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果與序列同源性結(jié)果一致，貴州白山羊同樣與綿羊親緣關(guān)系最近，符合物種進(jìn)化規(guī)律，說(shuō)明ADIPOQ基因編碼區(qū)在物種間相對(duì)保守。

2.2.11 貴州白山羊ADIPOQ基因在不同組織中的表達(dá)分析 如圖8所示，ADIPOQ基因mRNA在不同組織中的表達(dá)存在性別差異，其中在母羊脾臟、肺臟和心臟的表達(dá)量顯著高于公羊，而在公羊肝臟和腎臟中的表達(dá)量顯著高于母羊。

表5 山羊與10個(gè)物種ADIPOQ氨基酸序列同源性比

3 討論

ADIPOQ基因編碼蛋白是一種膠原血漿蛋白，已有研究結(jié)果表明其主要通過(guò)與受體1、2結(jié)合才能發(fā)揮作用[3]，進(jìn)而調(diào)節(jié)脂肪酸氧化和葡萄糖代謝等功能，這與本實(shí)驗(yàn)中蛋白互作分析預(yù)測(cè)結(jié)果一致，且是目前為止在脂肪細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的唯一與肥胖呈負(fù)相關(guān)的細(xì)胞因子，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其與II型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化及肥胖等多種疾病相關(guān)[12-13]。目前，國(guó)內(nèi)外少有針對(duì)云貴高原特有物種貴州白山羊ADIPOQ基因的研究，本實(shí)驗(yàn)對(duì)貴州白山羊ADIPOQ基因編碼產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)測(cè)和表達(dá)分析，為進(jìn)一步揭示白山羊ADIPOQ基因的遺傳功能特性提供理論參考。

本研究結(jié)果分析所得貴州白山羊ADIPOQ基因的分子大小、編碼蛋白質(zhì)大小、氨基酸同源性及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)同源性結(jié)果均一致，且與動(dòng)物分類(lèi)學(xué)觀點(diǎn)也基本一致，這說(shuō)明山羊ADIPOQ蛋白在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中較為保守，且起源進(jìn)化偏向于野生型分支。不同物種ADIPOQ基因序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)序列第4位堿基G為偏好基因，遵循Kozak規(guī)則，表明貴州白山羊ADIPOQ基因翻譯效率較高[14]。但氨基酸對(duì)比發(fā)現(xiàn)，不同物種氨基酸數(shù)目略有區(qū)別，發(fā)現(xiàn)貴州白山羊的總氨基酸數(shù)目比牛的少1個(gè)（牛：240個(gè)），比豬少4個(gè)（豬：243個(gè)），這可能與進(jìn)化過(guò)程中不同物種行使脂肪累積功能的差異有關(guān)。

本研究結(jié)果表明，ADIPOQ蛋白為親水性蛋白，且其存在信號(hào)肽區(qū)域，第18位氨基酸為潛在信號(hào)肽剪切位點(diǎn)，ADIPOQ蛋白結(jié)構(gòu)域功能分析也表明該蛋白1～17位信號(hào)肽區(qū)域，且101～237為較為保守的C1Q功能區(qū)，再結(jié)合ADIPOQ蛋白在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)其主要存在于胞外和分泌系統(tǒng)中，多角度證明ADIPOQ蛋白為分泌蛋白，這與ADIPOQ蛋白具體功能的體現(xiàn)需要結(jié)合受體才能實(shí)現(xiàn)的結(jié)果相一致[15]。

潛在磷酸化修飾位點(diǎn)分析結(jié)果表明，ADIPOQ蛋白在翻譯后可能受到磷酸化修飾的調(diào)控，而磷酸化是蛋白質(zhì)生物合成后活性調(diào)節(jié)的一種重要化學(xué)修飾，這可能與ADIPOQ蛋白與其受體結(jié)合有一定聯(lián)系相關(guān)。同時(shí)，ADIPOQ蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，ADIPOQ蛋白主要與ADIPOR1、ADIPIR2、CDH13和LEP蛋白進(jìn)行信息互作，這進(jìn)一步證明ADIPOQ蛋白主要與ADIPOR受體蛋白相結(jié)合共同行使相關(guān)功能，同時(shí)預(yù)測(cè)ADIPOQ蛋白并不是獨(dú)立行使脂肪的代謝調(diào)節(jié)功能，需要與CDH13蛋白和LEP蛋白等其他蛋白協(xié)同參與，CDH13蛋白在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用[16]，而LEP蛋白在調(diào)節(jié)脂肪沉積和能量代謝方面具有重要調(diào)節(jié)作用[17]。對(duì)貴州白山羊內(nèi)臟器官進(jìn)行ADIPOQ基因mRNA表達(dá)量檢測(cè)，結(jié)果表明在所檢測(cè)器官中均有表達(dá)，但在肺臟中表達(dá)量最高，在腎臟中表達(dá)量最低，這與李雪梅等研究結(jié)果存在差異[18]，但與陳宇光等[19]研究結(jié)果相似，結(jié)果均發(fā)現(xiàn)ADIPOQ基因mRNA在腎臟組織中的表達(dá)量最低，且這種表達(dá)存在性別差異，而ADIPOQ蛋白是一種與肥胖呈負(fù)相關(guān)的細(xì)胞因子，這種表達(dá)差異可能與公、母羊不同器官在脂肪累積中的功能差異相關(guān)。

4 結(jié)論

本研究得到了貴州白山羊ADIPOQ基因全長(zhǎng)720 bp的CDS區(qū)序列。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，貴州白山羊ADIPOQ基因編碼239個(gè)氨基酸，具有17個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，具有16個(gè)磷酸化位點(diǎn)、1個(gè)C1Q保守結(jié)構(gòu)域，屬于分泌蛋白，與綿羊、牦牛的親緣關(guān)系最近，與ADIPOR1/2、CDH13和LEP蛋白互作效應(yīng)最強(qiáng)，在腎臟中表達(dá)量最低，且在不同組織中的表達(dá)存在性別差異，預(yù)測(cè)ADIPOQ蛋白主要在脂肪調(diào)節(jié)功能具有關(guān)鍵作用，本研究為進(jìn)一步探討貴州白山羊在脂肪生長(zhǎng)過(guò)程中的功能研究奠定了遺傳信息基礎(chǔ)。