肺移植術(shù)后閉塞性細(xì)支氣管炎綜合征預(yù)測標(biāo)記物研究進(jìn)展

楊思佳 阿布都買拉木·阿布都吾甫爾 呂望 包飛潮 胡堅

肺移植是治療慢性阻塞性肺疾病、特發(fā)性肺纖維化、肺囊性纖維化等終末期肺部疾病的有效方法[1]。但是，肺移植患者的長期生存率顯著低于其他實體器官移植患者[2]。慢性移植物功能障礙是限制肺移植患者長期生存的主要原因[3]，由于術(shù)后閉塞性支氣管炎（bronchiolitis obliterans, BO）等并發(fā)癥的發(fā)生，肺移植患者5年生存率約為50%，而10年生存率僅為30%[4]。BO病理表現(xiàn)為間質(zhì)細(xì)胞浸潤終末呼吸道并引起纖維增生，閉塞性細(xì)支氣管炎綜合癥（bronchiolitis obliterans syndrome, BOS）是BO的臨床表述，表現(xiàn)為肺功能進(jìn)行性不可逆的下降，并排除急性排斥反應(yīng)，感染或者吻合口并發(fā)癥等原因[5]。目前，BOS主要的治療策略是抗炎治療，缺乏特異性的抗纖維化治療手段[6]。早期BOS患者可通過干預(yù)性治療延緩BOS的病程進(jìn)展，因此尋找具有良好相關(guān)性、且診斷敏感性較高的指標(biāo)，有利于BOS的早期診斷和治療。近年來研究證實，BOS發(fā)生發(fā)展相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞、細(xì)胞因子、金屬蛋白酶及抑制劑等指標(biāo)具有不等程度的作為BOS早期診斷標(biāo)記物的價值。本文就一部分相關(guān)研究較多、預(yù)測價值相對高的支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF）和外周血中的生物標(biāo)記物研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 中性粒細(xì)胞（neutrophilia, NE）

NE中性粒細(xì)胞在BOS的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。氣管內(nèi)NE增多導(dǎo)致成纖維細(xì)胞增殖和抗氧化防御枯竭，進(jìn)而造成氣道重塑和纖維化[7]。Neurohr等[8]報道了一項前瞻性研究，檢測63例肺移植患者術(shù)后3個月-12個月BALF中NE的含量；當(dāng)NE比例≥20%時，預(yù)測BOS的靈敏性為72%，特異性為93%。Verleden等[9]對380例肺移植患者隨訪發(fā)現(xiàn)，發(fā)展成BOS的79例患者術(shù)后第6、12、18和24個月BALF中NE含量均顯著高于正常肺移植患者（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001,P＜0.000,1）。Berastegui等[10]研究證實BOS組的BALF中，NE中位數(shù)和INF-γ水平顯著高于穩(wěn)定組，BALFNE可作為預(yù)測BOS的標(biāo)志。目前，已有較多報道[11-15]表明BALF中NE比例可以早期預(yù)測BOS的發(fā)生。在排除急性排斥反應(yīng)或淋巴細(xì)胞性支氣管炎等影響NE含量的干擾因素后，BALF中NE比例升高在預(yù)測BOS中的價值已被認(rèn)可。

2 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過抑制效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的過度活化，在維持移植耐受和控制自身免疫反應(yīng)中具有重要作用，其含量的異常與BOS的發(fā)生密切相關(guān)[16]。Bhorade等[17]評估了測定調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（T-lymphocytes regulatory,Treg）含量在預(yù)測BOS中的價值，通過流式細(xì)胞儀比較了14例正常肺移植患者和6例發(fā)展為BOS的肺移植患者血液和BALF中T細(xì)胞FoxP3的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)正常肺移植患者BALF中FoxP3+細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中所占的比例高于發(fā)展成為BOS的肺移植患者；同時發(fā)現(xiàn)術(shù)后2年內(nèi)，BALF中CD4+FoxP3+T細(xì)胞含量3.2%可作為預(yù)測BOS的臨界值，而且，F(xiàn)oxP3在CD4+T細(xì)胞中的比例不僅可以預(yù)測BOS，還能指導(dǎo)肺移植患者免疫抑制治療。Nakagiri[18]通過隨訪18例肺移植患者，提出了類似的觀點，認(rèn)為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞升高預(yù)示著患者術(shù)后肺功能良好。Durand等[19]發(fā)現(xiàn)，肺移植術(shù)后1個月，外周血中CD4+CD25hiFoxP3+T細(xì)胞含量2.4%可作為區(qū)分BOS患者和穩(wěn)定患者的界限，移植后6個月CD4+CD25hiFoxP3+T細(xì)胞含量2.4%以上的患者患BOS的風(fēng)險是其他患者的2倍。但也有學(xué)者持不同意見，Krustrup等[20]認(rèn)為組織活檢中FoxP3+細(xì)胞的密度不能作為預(yù)測BOS的指標(biāo)。

3 CD4+CD28+ T細(xì)胞

CD28作為協(xié)同刺激分子，與B7家族分子結(jié)合產(chǎn)生T細(xì)胞活化的共刺激信號在免疫應(yīng)答的T細(xì)胞激活中起重要作用，CD28表達(dá)異常與變態(tài)反應(yīng)、慢性免疫疾病、移植耐受等疾病有關(guān)。Studer等[21]采用流式細(xì)胞術(shù)分析肺移植患者外周血CD4+T細(xì)胞CD28的表達(dá)情況，移植術(shù)后6個月內(nèi)，CD4+CD28+/CD4+T細(xì)胞比例低于90%的患者第1秒用力呼氣量（forced expiratory volume in the first second,FEV1）下降（0.35±0.04）L，而CD4+CD28+/CD4+T細(xì)胞比例高于90%的患者FEV1下降（0.08±0.08）L，兩組間有顯著性差異（P＜0.013）；且CD4+CD28+/CD4+T細(xì)胞比例≤90%時，預(yù)測BOS發(fā)生的特異性為88%。Hodge等[22]也得出了相似的結(jié)果；通過分析58例肺移植患者外周血中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞表達(dá)CD28的情況，他們發(fā)現(xiàn)正常肺移植患者與發(fā)展成BOS的患者外周血中淋巴細(xì)胞總數(shù)及CD4、CD8在T細(xì)胞中百分比無顯著差異，而CD4+CD28-/CD4+T細(xì)胞、CD8+CD28-/CD8+T細(xì)胞比例有顯著差異，并且CD8+CD28-/CD8+T與FEV1相關(guān)（r=-0.675,P=0.001）。上述研究證實CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞低表達(dá)CD28可提示移植后較差的肺功能和BOS的發(fā)生，對BOS的發(fā)生起到預(yù)測作用。

4 間充質(zhì)干細(xì)胞

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stromal cells, MSC）是纖維增殖的初始效應(yīng)細(xì)胞，在組織器官動態(tài)平衡、損傷后修復(fù)的過程中發(fā)揮重要作用[23]。Badri等[24]測定162例肺移植患者術(shù)后不同時間點BALF中MSC菌落形成單位（colonyforming units, CFU）的數(shù)量，發(fā)展成BOS的患者BALF中間充質(zhì)干細(xì)胞CFU數(shù)量顯著高于正常肺移植患者；研究結(jié)果表明移植術(shù)后6個月，BALF中間充質(zhì)干細(xì)胞CFU≥10可以預(yù)測BOS的發(fā)生。MSC在肺部疾病的作用機(jī)制尚不清楚，有研究[25]表明MSC是通過內(nèi)皮素（endothelin-1, ET-1）發(fā)揮其促BOS的作用。目前，對于MSC達(dá)到多少數(shù)量才可以早期預(yù)測BOS的發(fā)生，以及MSC數(shù)量是否與BOS的程度相關(guān)尚未定論。

5 CC趨化因子

CC趨化因子具有募集淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞的作用，目前CC趨化因子在BOS病理過程中的重要作用已被重視[26]。研究[27]提示肺移植術(shù)后血清中胸腺和活化調(diào)節(jié)趨化因子（CCL17/TARC）水平可以作為BOS的預(yù)測指標(biāo)。Paantjens等[24]測定了54例肺移植患者術(shù)前、術(shù)后血清中TARC水平，發(fā)現(xiàn)測定術(shù)后第1年內(nèi)血清TARC水平有助于預(yù)測BOS，TARC≤325 pg/mL的患者發(fā)展成為BOS的特異性和靈敏性分別為71%和80%。Reynaud等[28]建議將其連同另一個CC趨化因子MCP-1作為預(yù)測BOS早期敏感診斷的指標(biāo)。Verleden等[29]通過檢測77例肺移植患者BALF中34種不同細(xì)胞因子的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)正常肺移植患者與發(fā)展成BOS的患者BALF中MCP-1、CCL3、CCL4、CCL17、CCL18的表達(dá)有顯著差異。上述研究提示檢測CC趨化因子對預(yù)測BOS有一定的價值。

6 可溶性蛋白

T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)在BOS的發(fā)生中具有重要的作用[30]。當(dāng)CD30+的T細(xì)胞活化后，釋放可溶性CD30（solubleCD30、sCD30）入血。Bauwens等[31]在術(shù)前檢測38例肺移植患者血清中sCD30的水平，發(fā)現(xiàn)術(shù)前高水平sCD30（＞20 U/mL）的患者與低水平sCD30（≤20 U/mL）患者相比有顯著的無BOS生存期優(yōu)勢。Golocheikine等[32]通過連續(xù)測定肺移植患者血清sCD30水平，發(fā)現(xiàn)發(fā)展成為BOS的患者較未發(fā)展成為BOS的患者血清sCD30升高（P＜0.05），在臨床診斷BOS的（7.57±2.63）個月前就發(fā)現(xiàn)了此差異，因此其建議將血清sCD30升高作為BOS的早期預(yù)測指標(biāo)。Fields等[33]持續(xù)跟蹤40例肺移植患者血清sCD30水平得到與Golocheikine相同的結(jié)論。

Kwakkel等[34]認(rèn)為不能將sCD30作為BOS的預(yù)測指標(biāo)，他們測定了14例接受他克莫司/霉酚酸酯治療方案的肺移植患者血清樣本中的sCD30水平，其中7例患者發(fā)展成為BOS，但在移植術(shù)前和術(shù)后均未發(fā)現(xiàn)與正?；颊呦啾萻CD30有統(tǒng)計學(xué)差異。Kwakkel的研究證明了他克莫司/霉酚酸酯不能通過抑制sCD30阻止BOS的發(fā)生，但未對sCD30在BOS預(yù)測中的價值進(jìn)行直接反駁。sCD30作為CD30活化釋放入血的活性成分，與CD30具有很好的相關(guān)性。血清中sCD30水平能夠反映活化的CD30+細(xì)胞數(shù)量。因此，測定血清sCD30水平在BOS預(yù)測中有一定的價值。

除可溶性CD30外，可溶性補(bǔ)體蛋白CD59（sCD59）也可作為BOS的預(yù)測指標(biāo)。Budding等[35]檢測了肺移植后BOS患者和非BOS患者的血清sCD59含量，發(fā)現(xiàn)sCD59量與BOS顯著相關(guān)。sCD59滴定＞400 pg/mL時，術(shù)后6個月患者生存率顯著低于sCD59滴定低組。

7 KL-6

KL-6表達(dá)于II型肺泡上皮細(xì)胞及呼吸性細(xì)支氣管上皮細(xì)胞，具有募集纖維母細(xì)胞促進(jìn)肺間質(zhì)纖維化的作用，血清KL-6水平與肺泡損傷、II型肺泡細(xì)胞再生和多種間質(zhì)性肺疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)[36]。受損傷的肺泡上皮細(xì)胞釋放KL-6促進(jìn)成纖維細(xì)胞分化成肌成纖維細(xì)胞[37]。Walter等[38]檢測了26例肺移植患者血清KL-6水平，其中8例為BOS患者，發(fā)現(xiàn)血清KL-6水平同F(xiàn)EV1下降相關(guān)（r=0.44,P＜0.05），BOS患者與正常肺移植患者血清KL-6濃度的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為（688.7±225.8）U/mL、（321.3±163.9）U/mL，該結(jié)果說明血清KL-6檢測有作為BOS早期診斷指標(biāo)的潛力。最近Haberman等[39]的研究也證明了血清KL-6在診斷BOS中的價值，KL-6≥200 U/mL早期預(yù)測BOS的敏感性為67%，特異性為95%；因此認(rèn)為血清KL-6可以作為移植術(shù)后早期診斷BOS的特異性指標(biāo)。Ohshimo等[40]比較了BALF中NE和血清KL-6對BOS的預(yù)測價值，認(rèn)為檢測血清KL-6較BALF中NE更有助于早期診斷BOS。

8 Clara細(xì)胞分泌蛋白

Clara細(xì)胞分泌蛋白（Clara cell secretory protein, CCSP）由分布于終末細(xì)支氣管和呼吸性細(xì)支氣管的無纖毛上皮細(xì)胞（Clara細(xì)胞）分泌，具有抗炎、抗纖維化的生物學(xué)活性。上皮損傷或非正常修復(fù)后，再生的上皮細(xì)胞失去分泌CCSP的能力。Nord等[41]進(jìn)行了一項包含22例肺移植患者的隊列研究，發(fā)展成為BOS的患者與急性排斥反應(yīng)或者無排斥反應(yīng)的患者相比，其血清和BALF中CCSP顯著下降，表明檢測血清和BALF中CCSP水平可以預(yù)測BOS的發(fā)生。Bourdin等[42]隨訪63例肺移植患者，發(fā)展成為BOS的患者在移植術(shù)后3個月內(nèi)BALF中CCSP水平和CCSP/IL-8比率已低于正?；颊?，并持續(xù)性下降，驗證了BALF中CCSP下降對于BOS的預(yù)測作用，同時提出供體CCSPA38G基因多態(tài)性與患者術(shù)后并發(fā)BOS相關(guān)。上述研究均表明術(shù)后CCSP下降，尤其是BALF中CCSP下降對BOS的預(yù)測作用。因此，CCSP的表達(dá)可能對BOS的發(fā)生有一定的預(yù)測作用。

9 內(nèi)皮素1

內(nèi)皮素1（endothelin-1, ET-1）是由21個氨基酸組成的多肽，具有調(diào)節(jié)血管舒縮張力、激素分泌等功能[43]。研究[43,44]表明ET-1對腫瘤，自身免疫疾病等的發(fā)生發(fā)展有影響。ET-1在肺移植物失功中的病理生理過程中發(fā)揮著重要作用，對預(yù)測移植物失功也有一定作用[25]。Salama等[45,46]證實了ET-1濃度升高在BOS預(yù)測中的價值，ET-1主要通過控制間充質(zhì)細(xì)胞來促進(jìn)BOS的發(fā)生；Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，術(shù)前ET-1濃度和術(shù)后3個月、12個月的血清ET-1濃度升高可以預(yù)測BOS，單因素比值比（univariate OR）和95%置信區(qū)間（con fidence interval, CI）分別為1.01（1.004-1.025）、3.1（1.21-9.92）、3.9（1.42-10.80）。上述研究說明ET-1在BOS的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，有可能通過控制其他細(xì)胞促纖維增生而使終末呼吸道纖維化，同時檢測血清和BALF中ET-1濃度在一定程度上可以預(yù)測或早期診斷BOS的發(fā)生。

10 金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）和金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitors of metalloproteinases, TIMPs）

上皮細(xì)胞損傷、炎癥、纖維化及氣道閉塞與術(shù)后閉塞性細(xì)支氣管炎相關(guān)[47]，纖維化是纖維增生（即細(xì)胞外基質(zhì)合成增加）和纖維分解（即細(xì)胞外基質(zhì)降解）不平衡的結(jié)果，包括MMPs和TIMPs在內(nèi)的蛋白質(zhì)參與胞外基質(zhì)成分平衡的維持[48]。研究[49]證實，MMPs和TIMPs在BOS患者肺組織中有表達(dá)改變。Hubner等[50]對出現(xiàn)肺纖維增生影像學(xué)表現(xiàn)的肺移植患者跟蹤測定MMP-9和TIMP-1的表達(dá)，結(jié)果顯示，BOS患者的移植肺表達(dá)MMP-9和MMP-9/TIMP-1比值均顯著升高。Smith等[51]研究證實BALF中MMP-8、MMP-9和TIMP-1在術(shù)后2年內(nèi)升高與之后發(fā)生BOS相關(guān)。亦有報道[12,51-58]表明MMPs家族的其他成員如MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-12等表達(dá)的改變與BOS發(fā)生相關(guān)，但這些MMPs在預(yù)測BOS中的價值現(xiàn)證據(jù)不夠充分。

11 MiRNAs和基因表達(dá)

Xu等[58]檢測了肺移植后兒童體內(nèi)循環(huán)miRNA的水平，發(fā)現(xiàn)BOS患者的miR-134、miR-10a、miR-195和miR-133b顯著低于非患病組，而miR-144、miR-142-5p和miR-155顯著低于非患病組。Budding等[59]認(rèn)為BOS患者血清中miR-21、miR-29a、miR-103和miR-191的水平顯著高于非BOS組。提示特定的miRNAs可作為預(yù)測BOS的指標(biāo)。

此外，Danger等[60]利用qPCR檢測外周血中的基因表達(dá)，對比BOS組和非BOS組，提出CD19、BLK、POU2AF1、TCL1A和IGLL5五種可作為預(yù)測標(biāo)記的高表達(dá)基因，以及IGLL5和TCL1A兩種可作為診斷標(biāo)記的基因。

12 結(jié)語

肺移植是治療終末期肺病的有效方法。受制于移植術(shù)后BOS的發(fā)生，肺移植長期生存率較低[1]，BOS的中位生存時間僅為3年-4年。尋找BOS的預(yù)測指標(biāo)，提高BOS的早期發(fā)現(xiàn)率并提前干預(yù)，有助于延長肺移植患者的生存[6]。經(jīng)過多年研究，已經(jīng)證實免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞、分泌性蛋白質(zhì)等指標(biāo)在預(yù)測肺移植術(shù)后BOS的發(fā)生中具有一定的價值，如NE、Treg、CD4+CD28+T細(xì)胞、白介素、C反應(yīng)蛋白、ET-1、KL-6等；其中NE、sCD30對預(yù)測BOS的研究較多，臨床應(yīng)用的價值較為認(rèn)可。同時，也有學(xué)者在探索其他類型的標(biāo)記物，如轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）[62]、微生物[63]、呼氣一氧化碳[64]、YKL-40[65]、1H NMR[66]、HLA-G[67]等。隨著BOS發(fā)生機(jī)制研究的深入，大樣本臨床試驗的開展，更多高靈敏度、特異性的BOS預(yù)測指標(biāo)將為肺移植術(shù)后BOS患者帶來長期生存的希望。