防治新冠肺炎醫(yī)療機構(gòu)制劑金香清瘟合劑的質(zhì)量標準研究

袁建平 李玲瑞 杜瑤

摘要：目的 建立金香清瘟合劑的質(zhì)量標準。方法 采用薄層色譜（TLC）法對制劑中的甘草、連翹進行鑒別;采用高效液相色譜法測定制劑中表兒茶素的含量。色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液，流速為1.0 mL/min，檢測波長為280nm，柱溫為30℃。結(jié)果 甘草、連翹的TLC圖斑點清晰，分離度好，陰性對照無干擾。表兒茶素檢測進樣量線性范圍為0.42μg～4.21μg（r=0.99996）;精密度、穩(wěn)定性、重復性的RSD<1.0%，加樣回收率為95.3%，RSD為1.0%（n=6）。結(jié)論 該方法操作簡單、重復性好，可用于金香清瘟合劑的質(zhì)量控制。

關鍵詞：新冠肺炎;金香清瘟合劑;質(zhì)量標準

【Abstract】Objective：To establish the quality standard of Jinxiang Qingwen Mixture. Methods：TLC was used to identify licorice and forsythia in the preparation and HPLC was used to determine the content of epicatechin in the preparation. The column was Agilent Eclipse Plus C18，the mobile phase was acetonitrile -0.1% phosphoric acid solution，the flow rate was 1.0 mL/min，the detection wavelength was 280 nm，and the column temperature was 30℃. Results：The TLC images of licorice and forsythia had clear spots and good separation，and the negative control had no interference. The linear range of the injection volume of epicatechin detection was 0.42μg～4.21μg（r=0.99996），the RSD of precision，stability and repeatability was less than 1.0%，the recovery rate was 95.3%，and the RSD was 1.0%（n=6）. Conclusion：The method is simple and has a good reproducibility，and can be used for the quality control of Jinxiang Qingwen Mixture.

【Key words】new coronary pneumonia，Jinxiang Qingwen Mixture，quality standard

自2019年12月以來，湖北省武漢市出現(xiàn)大量新型冠狀病毒肺炎（Novel coronavirus pneumonia，NCP）的患者，且疫情急劇發(fā)展并快速蔓延至全國。截止2020年2月28日，全國已有78959人感染新冠病毒，死亡2791例。國家衛(wèi)健委和中藥管理局印發(fā)的《新型冠狀動病毒感染的肺炎診療方案（試行第五版）》明確指出NCP屬于中醫(yī)疫病范疇，具人傳人的特點，以發(fā)熱、乏力、干咳為主要表現(xiàn)，少數(shù)患者伴有鼻塞、流涕、咽痛和腹瀉等癥狀[1]。從表里定病位，新冠肺炎病位在半表半里之間，大部分患者以發(fā)熱為主，舌苔厚膩，口干口苦，脈數(shù)，這些都是熱盛傷津證，留戀氣分不解，病位主要在肺、脾、肝、膽，其病機是正虛邪實[2]。本院根據(jù)本地特點及其病機提出預防及治療方—金香清瘟合劑，處方：金蕎麥、蜘蛛香、金銀花、連翹、蘆根、淡竹葉、薄荷、荊芥、桔梗、廣藿香、甘草，具有清熱解毒、芳香辟穢、利濕濕瘟、清肺利咽的功效。目前該制劑已獲得云南省醫(yī)療機構(gòu)制劑應急審批醫(yī)療機構(gòu)制劑注冊批件。為更好控制金香清瘟合劑的質(zhì)量，本研究參照文獻[3-9]，對處方中君藥金蕎麥中表兒茶素含量進行測定，并對其中的甘草、連翹進行薄層色譜鑒別，從而保證金香清瘟合劑安全、有效、穩(wěn)定，保障患者用藥。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1290型超高效液相色譜儀;ME104萬分之一電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）;ME55十萬分之一電子分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）;TG16 g，高速離心機（湖南凱達科學儀器有限公司）。

1.2 試劑 連翹甘對照品（批號：110821-210514，中國食品藥品檢定研究院）;連翹對照藥材（批號：120908-201216，中國食品藥品檢定研究院）;甘草對照藥材（批號：120904-201519，中國食品藥品檢定研究院）;表兒茶素（批號：110878-201703，含量以100.0%計，中國食品藥品檢定研究院）;乙腈為色譜純（賽默飛世爾科技有限公司）;磷酸（優(yōu)級純，西隴化工有限公司）;水為超純水。金香清瘟合劑（批號：20200214、20200215、20200218，曲靖市第一人民醫(yī)院制劑室）。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 甘草的薄層鑒別 取本品10 mL，用乙醚振搖提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取甘草對照藥材1 g，加水50 mL，煎煮30 min，放冷，濾過，濾液按供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。取缺甘草的樣品，按供試品溶液的制備方法制備成陰性對照樣品。照薄層色譜法（中國藥典2015版通則0502）試驗，吸取上述兩種溶液各10μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸（14：4：0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯兩個或兩個以上相同顏色的熒光斑點。

結(jié)果表明，供試品色譜中，與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，且陰性無干擾（見圖1），可以作為該制劑的質(zhì)量控制指標。

2.1.2 連翹的薄層鑒別 取本品20 mL，蒸至近干，加甲醇20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的水30 mL洗滌，取正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取連翹對照藥材1 g，加甲醇20 mL，超聲處理30 min，同法制成對照藥材溶液。再取連翹苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1mg的溶液，作為對照品溶液。取缺連翹的樣品，按供試品溶液的制備方法制備成陰性對照樣品。照薄層色譜法（中國藥典2015版通則0502）試驗。吸取供試品溶液及對照藥材溶液各10μl、對照品溶液5μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（9：1：0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。

結(jié)果表明，供試品色譜中，與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，且陰性無干擾（見圖2），可以作為該制劑的質(zhì)量控制指標。

2.2 相對密度、pH檢查 見表1。

2.3 表兒茶素含量測定

2.3.1 溶液的制備 對照品溶液的制備 取表兒茶素對照品10.56 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加乙腈-水（10：90）混合溶液溶解并定容，制成濃度為210.5664 ug·mL-1對照品儲備液，備用。

供試品溶液的制備 精密量取本品5 mL，加于聚酰胺柱（30～60目，內(nèi)徑為1.0 cm，柱長為12 cm，濕法裝柱）上，以水50 mL洗脫，棄去水液，再用乙醇150 mL洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮（50 ℃～70 ℃）至近干，殘渣用乙腈-水（10：90）混合溶液溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加乙腈-水（10：90）混合溶液稀釋至刻度，搖勻，取續(xù)濾液，即得。

陰性樣品溶液的制備 按照工藝制備缺金蕎麥金香清瘟合劑樣品，照供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。

2.3.2 色譜條件及系統(tǒng)試驗性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈為流動相A，以0.1%磷酸溶液為流動相B，按下表中的規(guī)定進行梯度洗脫;檢測波長為280nm;柱溫為30℃。理論板數(shù)按表兒茶素峰計算應不低于3000。見表2。

2.3.3 線性關系考察 精密吸取對照品儲備液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、10.0 mL置10 mL量瓶中，用乙腈-水（10：90）混合溶液稀釋并定容至刻度，得標準系列濃度，分別為 21.0566 ug/mL、42.1133 ug/mL、63.1699 ug/mL、84.2266 ug/mL、105.2832 ug/mL、210.5664 ug/mL。 吸取上述標準系列濃度各20 uL進樣，按“2.3.2”色譜條件下進行測定，以表兒茶素的濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，繪制標準曲線，得到表兒茶素的回歸方程為：Y=13 151.8X-316.775，r=0.999 96，在0.42 μg～4.21 μg范圍內(nèi)線性關系良好。見圖3。

2.3.4 專屬性 取缺金蕎麥的金香清瘟合劑樣品，同“2.3.1”項下方法處理，作為陰性樣品，按“2.3.2”色譜條件下測定，結(jié)果顯示，在與樣品主峰保留時間處未出現(xiàn)相應的色譜峰。

2.3.5 精密度 精密吸取濃度為105.2832 ug/mL的表兒茶素對照品溶液20 uL，按“2.3.2”色譜條件下連續(xù)進樣6次，記錄色譜峰的峰面積，結(jié)果峰面積的RSD%為0.089%，表明儀器的精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗 精密量取金香清瘟合劑5 mL，按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，室溫放置，分別于0、2、4、8、12、24h進行測定，記錄表兒茶素的峰面積，結(jié)果峰面積的RSD%為0.77%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復性試驗 精密量取金香清瘟合劑5 mL，按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，平行操作6份，按“2.3.2”色譜條件測定，記錄色譜峰的峰面積，結(jié)果峰面積的RSD%為0.35%，表明該方法重復性良好。

2.3.8 回收率試驗 精密量取金香清瘟合劑2.5 mL，共6份，每份分別加入對照品儲備液1.0 mL、1.0 mL;2.0 mL、2.0 mL;3.0 mL、3.0 mL，按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液。按“2.3.2”色譜條件，精密吸取上述6份供試品溶液20ul，注入液相色譜儀，照“2.3.2”色譜條件測定，記錄峰面積，外標法計算表兒茶素的平均加樣回收率，平均回收率為95.3%，回收率良好，RSD為1.0%，符合分析方法的要求。見表3。

2.3.9 樣品含量測定 取3批金香清瘟合劑，按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液20μl，按上述色譜條件測定，記錄色譜圖，外標法計算各供試品溶液中表兒茶素的含量。見表4、圖4。

3 討論

新型冠狀病毒感染的肺炎屬風溫夾濕，濕溫者癥狀較重，此病機為濕邪入肺化熱傷津擾及營血，治則應以除濕邪為主兼解熱清營，本方采用銀翹散加減，以金蕎麥為君藥具有清熱解毒、清肺排痰的功效[10]。馬蹄香、藿香為臣藥，芳香化濕辟穢，降低方藥的穢重之味，加重健脾利濕之功[11，12];金銀花、蘆根有抗上呼吸道及肺部感染的功用，馬蹄香、金銀花具有抗病毒作用[13]。蘆根、竹葉清熱生津，合金銀花、連翹具有透熱轉(zhuǎn)氣的作用[14，15];薄荷合金蕎麥、桔梗增強清肺止咳、潤肺化痰、利氣寬胸宣散風熱、清利咽喉的功效，三者同為佐助藥，甘草調(diào)和諸藥，適用于舌質(zhì)偏紅，苔薄白少津及薄黃者的預防和治療。

金香清瘟合劑有金蕎麥、蜘蛛香和其他藥材經(jīng)水提醇沉制成，所含成分較多，以君藥金蕎麥中表兒茶素含量為質(zhì)控指標，摸索質(zhì)控條件，并建立了金香清瘟合劑中表兒茶素的含量測定方法。在藥材前處理過程中，用乙腈-水（10：90）和用70%乙醇作溶劑，考察加熱回流20min和超聲20min，兩種提取方法結(jié)果均不理想，雜質(zhì)太大;后采用乙腈-水（10：90）超聲處理30min，再經(jīng)聚酰胺柱（30～60目，內(nèi)徑為1.0cm，柱長為12cm，濕法裝柱），以水50 mL洗脫，棄去水液，再用乙醇150 mL洗脫和直接取樣品按上述方法洗脫，結(jié)果差別不大，最終確定為直接取樣品進行洗脫。含量測定過程中，曾用流動相甲醇-0.004%磷酸（10：90和乙腈-0.1%磷酸梯度洗脫，檢測波長均為280nm，流速1.0 mL·min-1，柱溫30℃，結(jié)果表明，以乙腈-0.1%磷酸梯度洗脫的表兒茶素峰與雜質(zhì)峰分離度較好，達到基線分離，且柱效高。本文建立了金香清瘟合劑中的2個薄層鑒別和1個含量測定項，結(jié)果表明，本方法簡便易操作，結(jié)果準確，重復性和專屬性較好，大大提高了藥品的質(zhì)量可控性，以上研究可為金香清瘟合劑開發(fā)為安全、有效與可控的臨床制劑提供科學數(shù)據(jù)支持。

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