芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱綄?duì)腎小球系膜細(xì)胞Nrf2/HO-1信號(hào)通路的影響

金麗霞,金麗軍,欒仲秋,潘超,馬艷春*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040; 2.黑龍江牡丹江市腫瘤醫(yī)院頭頸乳腺一科，黑龍江 牡丹江 157000; 3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病臨床常見而且相對(duì)比較嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，也是慢性腎衰竭的常見病因[1]。DN病理多主要表現(xiàn)為系膜細(xì)胞不同程度的增生、腎小球硬化伴有不同程度的腎間質(zhì)纖維化[2]。糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制是多方面相互作用的復(fù)雜結(jié)果，主要機(jī)制局部RAAS系統(tǒng)激活、糖代謝紊亂、晚期糖基化產(chǎn)物、異常細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激反應(yīng)、遺傳因素等[3]。但是確切的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。高血糖可介導(dǎo)相關(guān)信號(hào)通路活化，進(jìn)而加重氧化應(yīng)激反應(yīng)，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為該機(jī)制在糖尿病引起腎臟損傷加重和發(fā)展中起到重要作用。既往研究表明[4]，Nrf2/ARE通路是重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路，其中核因子紅細(xì)胞衍生2相關(guān)因子/血紅素氧合酶(Nrf2/HO-1)是細(xì)胞內(nèi)抗氧化應(yīng)激非常重要的通路之一。對(duì)于糖尿病腎病的進(jìn)展起重要作用[5]。

芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱街饕牲S芪、酒蒸大黃、蒲公英、貓須草、積雪草、丹參、生牡蠣、淫羊藿、菟絲子等藥物組成，是在多年臨床實(shí)踐中不斷總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)方，一直應(yīng)用于臨床，是治療糖尿病腎病的有效方劑，療效確切。芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱街委熖悄虿∧I病的臨床應(yīng)用顯示芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱侥茱@著改善糖尿病腎病患者的臨床癥狀、體征及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，且無任何毒副作用。既往系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究也進(jìn)一步驗(yàn)證了芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱娇鼓I小球硬化和延緩糖尿病腎病進(jìn)展的作用機(jī)制，這無疑給更多的臨床糖尿病腎病患者帶來防病治病的希望，將極大的減輕社會(huì)和患者家庭的沉重負(fù)擔(dān)。該項(xiàng)目的開發(fā)和應(yīng)用，將進(jìn)一步為臨床治療提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康的Wistar大鼠60只，雄性，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(黑)2013-011。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：人腎小球系膜細(xì)胞購自上海富衡生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱街饕牲S芪、酒蒸大黃、蒲公英、貓須草、積雪草、丹參、生牡蠣、淫羊藿、菟絲子等藥物組成，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室制備。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

儀器：電熱恒溫培養(yǎng)箱，型號(hào)DH36001B，天津泰斯特公司。超純水系統(tǒng)，型號(hào)NW10LVF，中國Heal Force公司。顯微鏡及拍照系統(tǒng)分別為型號(hào)BX53及DP73，均購自日本OLUMPUS公司。試劑：HO-1購自Wanleibio公司，產(chǎn)地中國，貨號(hào)WL02400。Nrf2 購自Wanleibio公司，產(chǎn)地中國，貨號(hào)WL02135。生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG購自Beyotime公司，產(chǎn)地中國，貨號(hào)A0277。辣根酶標(biāo)記鏈酶親合素購自Beyotime公司，產(chǎn)地中國，貨號(hào)A0303。TritonX-100購自Beyotime公司，產(chǎn)地中國，貨號(hào)ST975。DAB顯色液購自Solarbio公司，產(chǎn)地中國，貨號(hào)DA1010。

1.4 主要配制試劑及其配制方法

0.1%TritonX-100：1 μLTriton×100溶于1 mLPBS中，充分混勻。0.1 M PBS：將29 g Na2HPO4與3 g NaH2PO4及85 g NaCl充分在 500 mL蒸餾水中溶解，并1 000 mL定容。0.01 M PBS：上述0.1 M PBS 100 mL與900 mL蒸餾水充分融合，再加入0.5 mL Tween-20混合后，用NaOH將酸堿度調(diào)節(jié)至pH7.2～7.4。

蘇木素：將0.4 g蘇木精加入50 mL無水乙醇中溶解備用，2 g硫酸鋁加入150 mL蒸餾水溶解，將配置兩者的溶液混勻，加熱沸騰后加入0.1 g碘酸鈉和0.2 g檸檬酸，冷卻至室溫。

2 實(shí)驗(yàn)方法及步驟

2.1 HMC的培養(yǎng)和傳代

將HMC細(xì)胞株復(fù)蘇后，將細(xì)胞懸液以5×105個(gè)/mL接種于培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每1～3 d換液1次，細(xì)胞生長至融合狀態(tài)，即可傳代。本實(shí)驗(yàn)選用3～10代的細(xì)胞。

2.2 芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱胶幯宓闹苽?/h3>

將Wistar大鼠60只適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組，即正常對(duì)照組、高糖組、芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岬汀⒅?、高劑量組，芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岬蛣┝拷M按0.243 g/(kg·d)、芪黃補(bǔ)腎泄?jié)嶂袆┝拷M按0.486 g/(kg·d)、芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岣邉┝拷M按0.972 g/(kg·d)的芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱焦辔附o藥，正常對(duì)照組及高糖組均給予與芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱酵葎┝康纳睇}水灌胃，各組大鼠灌胃每日1次，連續(xù)灌胃給藥1周。在末次灌胃后2 h麻醉，無菌操作腹主動(dòng)脈采血，3 000 rpm×15 min離心后取血清，56 ℃水浴滅活補(bǔ)體30 min，經(jīng)0.22 μm孔徑的針頭濾器過濾除菌，分裝后-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理

實(shí)驗(yàn)分5組，即正常對(duì)照組(A組)、高糖組(B組)、芪黃補(bǔ)腎低(C組)、中(D組)、高劑量組(E組)。A組HMC給予正常大鼠血清的培養(yǎng)液(血清濃度10%)培養(yǎng)，B組HMC予含正常大鼠血清的高糖培養(yǎng)液(血清濃度10%)培養(yǎng)，C組予含芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱降蛣┝亢幯宓母咛桥囵B(yǎng)液(血清濃度10%)培養(yǎng)干預(yù)，D組予含10%芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱街袆┝亢幯宓母咛桥囵B(yǎng)液(血清濃度10%)培養(yǎng)干預(yù)，E組予含10%芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱礁邉┝亢幯宓母咛桥囵B(yǎng)液(血清濃度10%)培養(yǎng)干預(yù)。

2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測Nrf2和HO-1的表達(dá)

0.1%TritonX-100孵育，3%過氧化氫孵育，血清封閉，一抗孵育，二抗孵育，辣根酶標(biāo)記，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鏡檢。

2.5 Western blot測定各組系膜細(xì)胞中Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)

蛋白質(zhì)的抽提：首先在室溫下融化本實(shí)驗(yàn)所需要的裂解液，把裂解液按實(shí)驗(yàn)所需分裝，分裝后加入體積1%的PMSF混合后留置備用。根據(jù)實(shí)驗(yàn)不同指標(biāo)樣本加入適當(dāng)體積的裂解樣本，在冰上靜置5 min。4 ℃條件下，用低溫冷凍離心12 000 rpm×10 min，分離上清即為所需的蛋白質(zhì)抽提物。

蛋白質(zhì)定量：將待測樣本蛋白抽提物與PBS緩沖液按1∶19混勻制備成蛋白質(zhì)待測液。BCA反應(yīng)：將A液：B液體積比50∶1配制好，加入各孔中，充分混勻后，放于37 ℃環(huán)境下反應(yīng)20 min，溶液由綠色變?yōu)樽仙?shù)據(jù)讀?。涸O(shè)定酶標(biāo)儀讀取波長為570 nm，記錄吸光OD值(A)。

2.6 Real-time PCR定量分析HO-1mRNA表達(dá)

各組細(xì)胞樣本提取總RNA后，使用紫外分光光度計(jì)NANO 2000測定各樣本中RNA的濃度。反轉(zhuǎn)錄：將上述所得到的RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以得到對(duì)應(yīng)的cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量分析,引物序列見表1。

表1 RT-PCR 引物序列

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 Nrf2、HO-1的表達(dá)結(jié)果

各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h末免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測Nrf2、HO-1的表達(dá)結(jié)果比較，與A組比較，B組細(xì)胞內(nèi)Nrf2、HO-1的表達(dá)較A組減少，與B組比較，C組、D組及E組細(xì)胞內(nèi)Nrf2、HO-1的表達(dá)增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見圖1、2。

圖1 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h末免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測Nrf2表達(dá)結(jié)果

圖2 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h末免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測HO-1表達(dá)結(jié)果

3.2 Western blot測定各組系膜細(xì)胞中Nrf2、HO-1蛋白的表達(dá)

各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h末Western blot測定各組系膜細(xì)胞中Nrf2、HO-1蛋白的表達(dá)結(jié)果比較，與A組比較，B組細(xì)胞內(nèi)Nrf2、HO-1的表達(dá)減少，與B組比較，C組、D組及E組細(xì)胞內(nèi)Nrf2、HO-1的表達(dá)增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表2，圖3、4。

表2 Western blot測定各組細(xì)胞中Nrf2、HO-1蛋白的表達(dá)

圖3 Western blot測定各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h末Nrf2及HO-1蛋白的表達(dá)

注：與A組比較,#P<0.05;與B組比較,*P<0.05圖4 Western blot測定各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h末Nrf2及HO-1蛋白的表達(dá)

3.3 Real-time PCR定量分析HO-1mRNA表達(dá)

本研究分析方法利用2-△△CT方法。本實(shí)驗(yàn)每種樣本每個(gè)基因平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行4個(gè)復(fù)孔，利用2-△△CT方法分析數(shù)據(jù),見表3，圖5。

表3 各組HMC48 h末HO-1表達(dá)相對(duì)值比較

注：與A組比較,# P<0.05;與B組比較,*P<0.05圖5 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h末 HO-1mRNA表達(dá)

Real-time PCR結(jié)果顯示，各組細(xì)胞HO-1mRNA在正常對(duì)照組可有少量表達(dá)，高糖刺激48 h后高糖組較對(duì)照組表達(dá)減少，不同劑量芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱剿幬镅宕碳ず蟊磉_(dá)增加，且以中劑量組和高劑量組表達(dá)增加更明顯，芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱娇赏ㄟ^上調(diào)高糖刺激下HMC中HO-1mRNA的表達(dá)，延緩DN的進(jìn)展。

4 討論

DN為一種較為常見的糖尿病慢性微血管并發(fā)癥[6]，是引起終末期腎臟病的重要原因，一些西方國家如歐美、日本等的統(tǒng)計(jì)資料顯示，DN已經(jīng)成為引起慢性腎衰竭的第一位病因[7]。我們國家DN 的發(fā)病率也在不斷升高。由于DN臨床癥狀不典型，容易不被引起注意，且病情發(fā)展迅速，往往確診時(shí)已處于不可逆階段，并很快進(jìn)展到終末期腎臟病。目前臨床上對(duì)DN治療效果不理想，尚沒有特效的治療手段。預(yù)后仍然是目前臨床醫(yī)生亟待解決的難題。如何提高臨床早期診斷率，早期采取積極有效的治療，延緩或逆轉(zhuǎn)糖尿病引起腎臟損傷是很多科研人員和一線醫(yī)生共同面對(duì)的重要課題。

雖然糖尿病進(jìn)展至腎臟損傷的發(fā)病機(jī)理還不是很清楚，但是越來越多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明體內(nèi)高血糖以及由此產(chǎn)生的氧化應(yīng)激與糖尿病腎臟損害有著密切的關(guān)聯(lián)。氧化應(yīng)激是各種有害因素?fù)p傷機(jī)體后，氧化應(yīng)激系統(tǒng)之間失衡，導(dǎo)致細(xì)胞或組織的病理性損害。DN是DM主要的微血管并發(fā)癥，氧化應(yīng)激在 DN的發(fā)病中起到關(guān)鍵作用。體內(nèi)持續(xù)存在的高血糖狀態(tài)會(huì)產(chǎn)生大量的 ROS， ROS腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞中的蓄積可進(jìn)一步引起腎臟內(nèi)基質(zhì)重構(gòu)、組織纖維化，促進(jìn) DN 的發(fā)展[8]。Nrf2/HO-1信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)抗氧化應(yīng)激最重要的通路之一，因此，調(diào)控Nrf2/HO-1信號(hào)通路有可能成為防治DN的新靶點(diǎn)。

Nrf2是Nrf2/HO-1信號(hào)通路的關(guān)鍵因子之一，也是其中樞調(diào)節(jié)者，Nrf2是近年來新發(fā)現(xiàn)的核轉(zhuǎn)錄因子，其具有堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，能夠識(shí)別ARE元件并與其結(jié)合，進(jìn)而轉(zhuǎn)錄表達(dá)一系列抗氧化應(yīng)激酶類或二相解毒酶，起到保護(hù)氧化應(yīng)激引起的器官損傷。Nrf2是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)抗氧化物表達(dá)的關(guān)鍵蛋白因子，對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化與抗氧化平衡起著重要的調(diào)節(jié)作用，具有抑制細(xì)胞凋亡、神經(jīng)保護(hù)和抗炎癥反應(yīng)等作用[9-10]。Nrf2作為一種轉(zhuǎn)錄因子，可以對(duì)各種抗氧化酶和II期解毒酶的不同基因進(jìn)行激活編碼，從而達(dá)到抗氧化應(yīng)激和清除ROS的作用[11]。生理情況下，Nrf2是結(jié)合其抑制劑Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Keap1)，保留在細(xì)胞質(zhì)中[12]無轉(zhuǎn)錄活性。當(dāng)受到相關(guān)因素刺激的情況下，Nrf2會(huì)從Keap1解離，導(dǎo)致Nrf2入核，引起抗氧化反應(yīng)元件(ARE)轉(zhuǎn)錄活化調(diào)節(jié)基因，其中包含血紅素加氧酶1(HO-1)[13]。HO-1是由其調(diào)節(jié)的下游非常重要的酶，形成Nrf2/HO-1途徑。HO-1可以降解血紅素，是一種應(yīng)激誘導(dǎo)型和氧化還原敏感性蛋白，從而有間接抗氧化的作用[14]。

Nrf2作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，可以減輕氧化應(yīng)激引起的器官損傷，在外界因素引起機(jī)體氧化應(yīng)激損傷時(shí)，可以誘導(dǎo)啟動(dòng)細(xì)胞保護(hù)基因的表達(dá)，激活Nrf2能夠緩解腎臟纖維化、腎缺血再灌注損傷等，是一個(gè)強(qiáng)有力的轉(zhuǎn)錄激活劑。HO-1也是機(jī)體內(nèi)對(duì)氧化應(yīng)激損傷起重要保護(hù)作用的一種抗氧化物酶蛋白，抗氧化能力非常強(qiáng)大。既往相關(guān)研究已表明在炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中NF-κB是一個(gè)非常重要的調(diào)控因素， Nrf2/HO-1 通路與 NF-κB通路又存在著密切的關(guān)聯(lián)，Soares等[15]相關(guān)研究表明HO-1是Nrf2信號(hào)通路與NF-κB信號(hào)通路樞紐因子，通過激活Nrf2通路可以上調(diào)HO-1的表達(dá)，能減輕機(jī)體的炎癥反應(yīng)。研究結(jié)果也表明Nrf2/HO-1通路在體內(nèi)承擔(dān)著重要的調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的功能，轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核的被激活的Nrf2，與ARE作用后上調(diào)HO-1抗氧化酶表達(dá)水平及活性，發(fā)揮抗氧化作用[16]。

本研究結(jié)果中免疫細(xì)胞化學(xué)及Western blot結(jié)果顯示，正常大鼠血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞可以少量表達(dá)Nrf2 及 HO-1，加入高糖刺激后Nrf2 及 HO-1表達(dá)減少，加入不同劑量的芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱剿幬镅搴螅琋rf2 及 HO-1表達(dá)增加，通過Real Time PCR進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱娇缮逪O-1mRNA的表達(dá)，活化Nrf2/HO-1通路發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用。

綜上所述，氧化應(yīng)激反應(yīng)在DN發(fā)生發(fā)展中起重要作用，芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱娇稍黾痈咛桥囵B(yǎng)下人腎小球系膜細(xì)胞Nrf2及 HO-1的表達(dá)。我們推測芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱娇赏ㄟ^調(diào)節(jié) Nrf2/HO-1信號(hào)通路減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而緩解DN,為芪黃補(bǔ)腎泄?jié)岱竭M(jìn)一步臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。