原發(fā)性膽汁性肝硬化患者外周血I型干擾素信號(hào)通路分析

黃元蘭，李 丹，仲人前

原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)是一類好發(fā)于中年女性的器官特異性自身免疫性疾病，以膽管內(nèi)進(jìn)行性非化膿性炎癥為病理學(xué)特征，以抗線粒體抗體(AMA)陽(yáng)性為血清學(xué)特征[1]。持續(xù)的炎癥反應(yīng)損傷了膽管上皮細(xì)胞，導(dǎo)致膽道閉塞和膽汁淤積。長(zhǎng)期的膽汁淤積又加重了膽管內(nèi)的炎癥反應(yīng)，由此形成的“惡性循環(huán)”，最終會(huì)引起肝臟的纖維化和肝功能衰竭[2]。

干擾素共分為3種類型，分別為I型、II型和III型。其中，I型干擾素主要包括干擾素-α(IFN-α)和IFN-β，二者主要通過(guò)內(nèi)分泌或旁分泌的方式發(fā)揮作用[2]。當(dāng)I型干擾素與其受體結(jié)合后，可以啟動(dòng)多個(gè)基因的表達(dá)。這些基因通常被稱為干擾素誘導(dǎo)基因(ISG)。從I型干擾素與其受體結(jié)合到ISG表達(dá)的信號(hào)通路被稱為I型干擾素信號(hào)通路。以往的研究表明，I型干擾素信號(hào)通路亢進(jìn)是多種自身免疫性疾病的共同特征[3-4]。但是PBC患者I型干擾素信號(hào)通路是否亢進(jìn)仍不明確。

在本研究中，筆者分析了PBC患者外周血I型干擾素濃度以及外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)內(nèi)多個(gè)ISG的表達(dá)，以分析I型干擾素信號(hào)通路是否亢進(jìn)及是否參與了PBC的發(fā)病機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2012年5-12月于海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院和長(zhǎng)海醫(yī)院確診的38例PBC患者為研究對(duì)象(PBC組)。其中：男9例，女29例，平均年齡為51歲。PBC的診斷標(biāo)準(zhǔn)為美國(guó)肝病學(xué)會(huì)2000年推薦的PBC診斷指南[5]。所有的PBC患者均未合并其他自身免疫性疾病、惡性腫瘤和終末期腎病，在血液標(biāo)本采集前的1個(gè)月內(nèi)也無(wú)明顯的感染性疾病病史。對(duì)照組為同期來(lái)該院體檢的患者中選擇了30例健康人群作為對(duì)照組。PBC組和對(duì)照組的臨床特征見表1。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明PBC患者的肝酶、膽紅素等指標(biāo)均較健康個(gè)體增高，2組患者在年齡和性別構(gòu)成比上的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究得到了該校倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署了知情同意書。

表1 對(duì)照組和PBC組患者的臨床特征

1.2 ELISA檢測(cè) 于患者接受治療前，抽取患者靜脈血5 ml，以EDTA-K2抗凝。以3 000 r/min(離心半徑r=20 cm)的速度離心10 min分離血漿。將血漿分裝至EP管中，置于-80 ℃保存待測(cè)。待所有血清收集完成后，室溫下復(fù)融，采用ELISA法檢測(cè)血漿IFN-α和IFN-β水平，ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司，實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程均按照實(shí)際說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 PCR擴(kuò)增 采用密度梯度離心法分離受試對(duì)象PBMC，之后采用Trizol法提取總RNA，隨后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，檢測(cè)3個(gè)ISG(IFIT3、MX1和OAS1)的表達(dá)，所用內(nèi)參為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。IFIT3的正向引物序列為AACTACGCCTGGGTCTACTATCACTT，反向引物序列為GCCCTTTCATTTCTTCCACAC；MX1的正向引物序列為GGGTAGCCACTGGACTGA；反向引物序列為 AGGTGGAGCGATTCTGAG；OAS1的正向引物序列為GAAGGCAGCTCACGAAAC，反向引物序列為 TTCTTAAAGCATGGGTAATTC；GAPDH的正向引物序列為CCATCAATGACCCCTTCATTG，反向引物序列為CATGGGTGGAATCATATTGGAAC。每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔，Ct值為3復(fù)孔的均值。根據(jù)公式ΔCt=[Ct(目的基因)]-[Ct(內(nèi)參基因)]和ΔΔCt=[ΔCt(疾病組)]-[ΔCt(對(duì)照組)]，計(jì)算2-ΔΔCt，即為疾病組各基因表達(dá)量相對(duì)于正常組的倍數(shù)[6]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或者M(jìn)ann-Whitney U檢驗(yàn)比較2組數(shù)據(jù)之間的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)處理過(guò)程均在SPSS 17.0 for Windows或GraphPad Prism 6.0中進(jìn)行。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 PBC患者外周血IFN-α和IFN-β水平分析 如圖1所示，與對(duì)照組相比，PBC患者外周血IFN-α和IFN-β水平明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

注：與對(duì)照組比較aP<0.01。PBC為原發(fā)性膽汁性肝硬化，IFN為干擾素圖1 PBC組和對(duì)照組血清I型干擾素水平比較

2.2 PBC患者PBMC中干擾素刺激基因(IFIT3、MX1和OAS1)的表達(dá)分析 如圖2所示，PBC患者PBMC中的干擾素刺激基因(IFIT3、MX1和OAS1)較健康個(gè)體明顯增高(均P<0.01)。

注：與對(duì)照組比較a，P<0.01。PBC為原發(fā)性膽汁性肝硬化圖2 PBC組和對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞中干擾素刺激基因的表達(dá)

3 討論

I型干擾素主要包括IFN-α和IFN-β，其免疫學(xué)功能主要是直接抑制病毒的復(fù)制，此外還具有重要的免疫調(diào)理作用，可以通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的方式間接發(fā)揮抗病原體效應(yīng)[7-8]。I型干擾素生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮主要是通過(guò)干擾素刺激基因來(lái)實(shí)現(xiàn)的，當(dāng)I型干擾素與其受體IFNAR結(jié)合后，胞內(nèi)的STAT1和STAT2形成二聚體，并進(jìn)一步與IRF9組裝，形成了干擾素刺激基因因子3(ISGF3)。ISGF3進(jìn)入細(xì)胞核之后，可以啟動(dòng)多個(gè)基因的表達(dá)，這些基因就是干擾素刺激基因。干擾素刺激基因的生物學(xué)功能十分廣泛，包括正向或負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的強(qiáng)度等。I型干擾素反應(yīng)就是指I型干擾素誘導(dǎo)干擾素刺激基因表達(dá)的過(guò)程。

I型干擾素反應(yīng)是把雙刃劍，雖然適當(dāng)?shù)腎型干擾素反應(yīng)有助于免疫系統(tǒng)清除病原體，但是I型干擾素反應(yīng)亢進(jìn)則會(huì)引發(fā)自身免疫性疾病。在本研究中，筆者首先采用ELISA法檢測(cè)了PBC患者外周血的I型干擾素(IFN-α/β)水平，發(fā)現(xiàn)PBC患者外周血I型干擾素水平較健康個(gè)體明顯增高。同時(shí)，筆者還采用了PCR法檢測(cè)了PBC患者PBMC中的3個(gè)干擾素刺激基因的表達(dá)情況，且表達(dá)明顯增高，這提示I型干擾素反應(yīng)亢進(jìn)是PBC的重要特征。

以往的研究表明，PBC的發(fā)病機(jī)制與感染有關(guān)[9]，而感染本身又會(huì)活化I型干擾素信號(hào)通路。筆者推測(cè)，在PBC發(fā)病過(guò)程中可能存在如下過(guò)程，病原體感染首先導(dǎo)致個(gè)體外周血I型干擾素增加，進(jìn)而活化了I型干擾素反應(yīng)。I型干擾素反應(yīng)亢進(jìn)后導(dǎo)致了肝臟的自身免疫反應(yīng)，肝臟膽管上皮細(xì)胞被免疫系統(tǒng)殺傷后，釋放了較多的自身抗原。這些自身抗原可以進(jìn)一步導(dǎo)致又進(jìn)一步促進(jìn)了免疫反應(yīng)，導(dǎo)致I型干擾素反應(yīng)的持續(xù)活化，形成了惡性循環(huán)。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)PBC患者外周血I型干擾素信號(hào)通路過(guò)度活化，結(jié)合以往關(guān)于I型干擾素信號(hào)通路參與自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)理的研究證據(jù)，提示I型干擾素信號(hào)通路是PBC潛在的治療靶點(diǎn)。