胰腺癌患者血清中LncRNA UCA1的表達(dá)及臨床意義

何勇勇，儲(chǔ)成牛，程 利

(1.宣城職業(yè)技術(shù)學(xué)院內(nèi)科教研室；2.宣城市人民醫(yī)院普外科，安徽 宣城 242000)

胰腺癌是消化系統(tǒng)惡性腫瘤，因其起病隱匿，發(fā)展迅速，導(dǎo)致診斷延遲和預(yù)后較差[1]，且胰腺癌發(fā)病率逐年上升，死亡率已位居中國(guó)惡性腫瘤第七位[2]。手術(shù)切除仍然是胰腺癌的主要治療方法，但腫瘤切除術(shù)的患者5年生存率低至6%[3]。提高胰腺癌預(yù)后的關(guān)鍵在于早期診斷和早期治療，通過在高?；颊哐褐袡z測(cè)相關(guān)分子標(biāo)志物是一種有效方法。目前CA19-9是診斷胰腺癌最可靠的腫瘤標(biāo)志物，但其陽(yáng)性率無法令人滿意[4-6]。因此，探索高表達(dá)胰腺癌相關(guān)腫瘤標(biāo)志物是臨床研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類長(zhǎng)度超過200bp無蛋白質(zhì)編碼功能的轉(zhuǎn)錄物[7]，研究證實(shí)LncRNA參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，并在無細(xì)胞的體液中穩(wěn)定表達(dá)和檢測(cè)[8-12]，眾多實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明循環(huán)血液中的LncRNA可作為分子標(biāo)志物用于惡性腫瘤的診斷。例如，Tan等[13]發(fā)現(xiàn)多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者循環(huán)血液中LncRNA HOTAIR高于健康成年人，ROC曲線分析結(jié)果證實(shí)血清LncRNA HOTAIR診斷多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤曲線下面積為0.913，其敏感性和特異性為87.5%和86.1%；另一項(xiàng)中國(guó)研究發(fā)現(xiàn)LncRNA CCAT2在胃癌患者血清中高表達(dá)，并可用于早期胃癌診斷[14]。

LncRNA UCA1位于人類染色體19p13.12上，最初在膀胱癌中被發(fā)現(xiàn)[15]，隨后研究發(fā)現(xiàn)LncRNA UCA1在食管癌、膽囊癌和肝癌患者血清中表達(dá)高于健康對(duì)照組[16-18]。然而LncRNA UCA1在胰腺癌中作用研究較少，本研究通過觀察LncRNA UCA1在胰腺癌血液中的表達(dá)情況，了解其對(duì)胰腺癌的診斷和預(yù)后價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選取宣城市人民醫(yī)院普外科2012年1月至2018年11月收治的胰腺癌患者60例作為研究對(duì)象，其中男44例，女16例；年齡47～71歲，平均(60.820±5.916)歲。術(shù)后腫瘤標(biāo)本經(jīng)兩位高年資病理科醫(yī)生檢查均確診為胰腺癌；患者手術(shù)前未經(jīng)過其他治療。另收集同期參加常規(guī)體檢的60名健康志愿者作為對(duì)照組，其中男44例，女16例；年齡47～71歲，平均(60.800±5.911)歲。兩組患者性別和年齡等資料無差異性。采集胰腺癌患者前術(shù)3d、術(shù)后7d及健康志愿者空腹靜脈血10mL，血液樣本2500r/min離心后取上清交與上海吉瑪生物公司，該生物公司收到樣本后隨即對(duì)血清中的LncRNA UCA1進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 血清LncRNA UCA1的檢測(cè)按Trizol說明書提取胰腺癌患者術(shù)前術(shù)后及健康志愿者血清中的總RNA，使用紫外分光光度計(jì)對(duì)RNA進(jìn)行檢測(cè)；RNA濃度和純度合格后按照PrimeScript TM RT reagent kit說明書將其逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系為20μL，反應(yīng)條件：42℃30min，95℃2min；隨后以合成cDNA為模板按照SYBR Premix ExTM TaqⅡ試劑盒說明書配制反應(yīng)體系和設(shè)置反應(yīng)條件，反應(yīng)體系為20μL，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性20s，隨后95℃10s、60℃25s，循環(huán)40次，采用2-△△Ct方法計(jì)算血清中LncRNA UCA1相對(duì)表達(dá)量。LncRNA UCA1上游引物：5'-TTCCTTATTATCTCTTCTG-3'，下游引物：5'-TCCATCATACGAATAGTA-3'；內(nèi)參GAPDH上游引物：5'-CTCGCTTTGGCAGCACA-3'，下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.3 隨訪患者出院時(shí)開始隨訪，主要方式為電話及門診隨訪；截止時(shí)間至2019年6月21日，60例胰腺癌患者均死亡，無失訪病例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件，LncRNA UCA1表達(dá)差異及與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系采用t檢驗(yàn)；ROC分析LncRNA UCA1對(duì)胰腺癌的診斷價(jià)值；利用Kaplan-meier描繪胰腺癌患者的生存曲線，Log-rank比較LncRNA UCA1高低表達(dá)組間的生存率；Cox回歸模型分析影響胰腺癌患者的危險(xiǎn)因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA UCA1在胰腺癌患者血清中的表達(dá)術(shù)前胰腺癌患者血清中LncRNA UCA1表達(dá)量高于健康對(duì)照組[(3.604±0.753)vs(2.889±0.438)，t=6.361，P<0.001]，和術(shù)后胰腺癌患者[(3.604±0.753)vs(2.947±0.415)，t=5.922，P<0.001]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而術(shù)后胰腺癌患者和健康對(duì)照組血清中LncRNA UCA1表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.745，P=0.458)。上述結(jié)果表明胰腺癌患者血清中LncRNA UCA1表達(dá)量顯著高于健康人，胰腺腫瘤切除術(shù)后其表達(dá)量下降至正常健康人水平，見圖1。

圖1 各組血清中LncRNA UCA1的表達(dá)水平比較

2.2 血清中LncRNA UCA1表達(dá)對(duì)胰腺癌患者臨床診斷的可靠性分析ROC曲線分析顯示LncRNA UCA1診斷胰腺癌的曲線下面積為0.813(95%CI:0.742～0.845，P<0.01)。診斷胰腺癌的LncRNA UCA1最優(yōu)截?cái)嘀禐?.295，其敏感性和特異性為65%和85.8%，見圖2。

圖2 LncRNA UCA1對(duì)胰腺癌診斷價(jià)值

2.3 血清中LncRNA UCA1表達(dá)與病理特征之間的關(guān)系統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者血清中LncRNA UCA1表達(dá)與性別和年齡無相關(guān)性(P>0.05)；CA19-9 ≥40 U/L、細(xì)胞分化程度低、腫瘤直徑>3cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期Ⅲ期的胰腺癌患者LncRNA UCA1表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見表1。

表1 LncRNA UCA1表達(dá)與胰腺癌病理參數(shù)的相關(guān)性(n=60)

2.4 血清中LncRNA UCA1表達(dá)與胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)系以LncRNA UCA1在60例胰腺癌患者血清中相對(duì)表達(dá)量(2-△△Ct)的中位值為界，將患者分成LncRNA UCA1高表達(dá)組和低表達(dá)組。采用Kaplan-Meier法繪制胰腺癌患者生存曲線，分析結(jié)果顯示LncRNA UCA1高表達(dá)組患者中位生存時(shí)間為3.9個(gè)月(95%CI：3.149～4.651)，無瘤中位生存時(shí)間為2個(gè)月(95%CI：1.540～2.460)；低表達(dá)組中位生存時(shí)間為7.6個(gè)月(95%CI：5.990～9.210)，無瘤中位生存時(shí)間為3個(gè)月(95%CI：2.732～3.268)，見圖3和圖4。Log-rank分析顯示LncRNA UCA1高表達(dá)組總體生存率和無瘤生存率均低于低表達(dá)組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.222，P<0.001；χ2=14.202，P<0.001)。Cox多因素分析顯示胰腺癌患者術(shù)前血清中LncRNA UCA1表達(dá)、腫瘤分化程度和TNM分期是影響胰腺癌患者總體生存的獨(dú)立影響因素(P均<0.05)，見表2。

圖3 胰腺癌患者血清中LncRNA UCA1表達(dá)與總體生存率的關(guān)系

圖4 胰腺癌患者血清中LncRNA UCA1表達(dá)與無瘤生存率的關(guān)系

表2 影響胰腺癌患者預(yù)后的Cox單因素和多因素分析

3 討論

近年來，眾多研究結(jié)果表明LncRNAs與蛋白質(zhì)編碼基因相似可以作為癌基因參與多種腫瘤發(fā)生過程，包括增殖、侵襲、遷移和凋亡[8]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)快速發(fā)展，發(fā)現(xiàn)越來越多的功能性LncRNAs具有預(yù)測(cè)癌癥發(fā)生和進(jìn)展的潛在價(jià)值。lncRNA UCA1是一種新型的功能性lncRNA，于2006年在人膀胱癌中首次發(fā)現(xiàn)[19]。隨后的研究表明lncRNA UCA1在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，如：胃癌、肝癌和肺癌等，并參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和凋亡，在腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中起重要作用[20]。

本研究結(jié)果表明術(shù)前胰腺癌患者血清中LncRNA UCA1表達(dá)量顯著高于健康志愿者(P<0.001)，而術(shù)后胰腺癌患者血清中LncRNA UCA1表達(dá)量較術(shù)前顯著下降(P<0.001)；ROC曲線結(jié)果證實(shí)血清中LncRNA UCA1表達(dá)可以作為胰腺癌患者早期診斷指標(biāo)，其曲線下面積為0.813(95%CI: 0.742～0.845，P<0.01)，敏感性和特異性分別為65%和85.8%；進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析證實(shí)細(xì)胞分化程度低、腫瘤直徑>3cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期Ⅲ期的胰腺癌患者LncRNA UCA1表達(dá)升高(P均<0.05)。隨后采用Kaplan-Meier生存曲線分析LncRNA UCA1與胰腺癌患者的相關(guān)性，其結(jié)果顯示血清高表達(dá)LncRNA UCA1的患者總體生存率和無瘤生存率均顯著下降(P均<0.001)；Cox多因素分析表明胰腺癌患者術(shù)前血清中LncRNA UCA1表達(dá)、腫瘤分化程度和TNM分期是影響胰腺癌患者總體生存的獨(dú)立影響因素(P均<0.05)，這些研究結(jié)果顯示血清中LncRNA UCA1表達(dá)與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。Zhou等[21]的一項(xiàng)研究結(jié)果顯示LncRNA UCA1可以結(jié)合miR-96來調(diào)節(jié)FOXO3的表達(dá)，從而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和減少細(xì)胞凋亡，這表明UCA1/miR-96/FOXO3軸參與了胰腺癌的進(jìn)展；Chen等[22]發(fā)現(xiàn)LncRNA UCA1能夠抑制P27的表達(dá)以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和胰腺癌細(xì)胞的增殖，高表達(dá)LncRNA UCA1患者總生存期較短；此外，Tang[23]等利用基因芯片發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織中LncRNA UCA1表達(dá)高于健康對(duì)照組，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)LncRNA UCA1可以結(jié)合miR-485-p調(diào)節(jié)FZD7蛋白表達(dá)進(jìn)而通過Wnt通路影響胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，臨床統(tǒng)計(jì)分析表明胰腺癌組織中LncRNA UCA1表達(dá)可以作為胰腺癌的診斷指標(biāo)，高表達(dá)患者預(yù)后較差。這些研究均證實(shí)了LncRNA UCA1通過多種途徑參與了胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展，可以作為胰腺癌的診斷和預(yù)測(cè)因子。

本文創(chuàng)新之處在于利用RT-PCR檢測(cè)出胰腺癌患者血液中LncRNA UCA1的表達(dá)高于健康對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)分析證實(shí)了血液中LncRNA UCA1表達(dá)可以作為胰腺癌患者術(shù)前診斷和術(shù)后預(yù)后判斷指標(biāo)?；颊哐簶颖据^腫瘤組織易于采集，因此檢測(cè)血液中LncRNA UCA1表達(dá)具有較高臨床實(shí)用性，可作為胰腺癌篩查、診斷和預(yù)后標(biāo)志物。但由于本研究樣本量較少，仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證LncRNA UCA1在胰腺癌中的診療價(jià)值；同時(shí)，繼續(xù)探索LncRNA UCA1在胰腺癌中具體的致癌機(jī)制和生物學(xué)行為，為臨床診治提供理論依據(jù)。