第29屆國(guó)際生物學(xué)奧林匹克競(jìng)賽試題 實(shí)驗(yàn)1 生物化學(xué)和分子生物學(xué)

楊 揚(yáng) 張 立 張雁云 范六民 周 潔

（1 清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 北京 100084 2 北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 北京 100875 3 北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 北京 100871 4 華中師范大學(xué)第一附屬中學(xué) 湖北武漢 430223）

總分：100 分 時(shí)間：90 min

一般信息

●流程說明和答題紙將在你位置的信封中提供。

●總分：100 分。

●考試時(shí)間：90 min。

●請(qǐng)將你的學(xué)生代碼寫入標(biāo)題頁(yè)左上角的框中。

●將提供單獨(dú)的答題紙，用于寫下所有答案。寫在問題紙上的答案將不會(huì)得分。

●為了出示小旗，請(qǐng)將其置于桌子左墻上的旗架（=小管）中。

●請(qǐng)確保你的位置有全部材料和設(shè)備。如果缺少任何東西，你必須在哨聲開始后5 min 內(nèi)通過出示黃旗報(bào)告。5 min 后申報(bào)缺少任何物品將不予考慮。

●如遇緊急情況，請(qǐng)將你的黃旗置于旗架上。

●在實(shí)驗(yàn)過程中，如出錯(cuò)不提供額外的材料。

●建議你在開始之前通過閱讀整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程熟悉實(shí)驗(yàn)。

●當(dāng)考試結(jié)束終止哨聲響起時(shí)，應(yīng)立即停止答題。將整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程與答題紙一起放入信封中。實(shí)驗(yàn)監(jiān)考人員將收取信封。

●當(dāng)哨聲停止時(shí)，如果你已將綠旗置于旗架上，但你的凝膠圖尚未拍完，請(qǐng)站在你的位置旁邊，直到實(shí)驗(yàn)監(jiān)考人員來拍照。

祝你好運(yùn)。

在下表中寫出提示的數(shù)字。

?

材料：哨聲響起后5 min 之內(nèi)檢查并報(bào)告有任何缺少的材料。

A.生物的

1.500 μL 細(xì)菌裂解物（標(biāo)記為“Bacteria lysate BL”；在框中）；

2.500 μL BSA 溶液，1 mg/mL（標(biāo)記為“BSA”；在框中）；

3.30 μL 質(zhì)粒DNA，250 ng/μL（標(biāo)記為“plasmid DNA”；在框中）；

4.10 μL DNA酶（標(biāo)記為“DNase,0.015 Units/μL”）置于冰上；

5.20 μL DNA 大小標(biāo)記物（標(biāo)記為“DNA size marker”；在框中）。

B.非生物的

1.垃圾桶（標(biāo)記為“Waste bucket”）；

2.1 mL 裂解緩沖液（標(biāo)記為“Lysis buffer LB”；在框中）；

3.2 mL 緩沖液A（分布在2 個(gè)管中，每個(gè)管標(biāo)記為“Buffer A”；在框中）；

4.1 mL 緩沖液B（標(biāo)記為“Buffer B”；在框中）；

5.3 mL 磷酸鹽緩沖鹽水（分布在2 個(gè)管中，每個(gè)標(biāo)記為“PBS”；在框中）；

6.8 μL DNase 反應(yīng)緩沖液（標(biāo)記為“DNase buffer”）置于冰上；

7.50 μL 凝膠上樣染料（標(biāo)記為“Loading dye”；在框中）；

8.26×1.5 mL 管（在框中）；

9.4.2 mL Bradford 試劑（在15 mL 管中）（標(biāo)記為“Bradford reagent”）；

10.親和層析柱（標(biāo)記為“Column”；置于柱架上）；

11.微量移液器特殊吸頭（標(biāo)記為“MST”）；

12.色譜柱架（標(biāo)記為“Column holder rack”）；

13.用于餾分收集的管架（標(biāo)記為“Tube rack”）；

14.2～20 μL 微量移液器；

15.20～200 μL 微量移液器；

16.100～1 000 μL 微量移液器；

17.用于2～20 μL 和20～200 μL 微量移液器的黃色吸頭；

18.用于100～1 000 μL 微量移液器的藍(lán)色吸頭；

19.96 孔板（有學(xué)生名字）；

20.鋁箔；

21.有電源的瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)；

22.含有結(jié)合DNA 染色劑的瓊脂糖凝膠（已置于電泳系統(tǒng)中）；

23.一次性手套；

24.護(hù)目鏡；

25.防水記號(hào)筆；

26.3 面旗幟，紅色、綠色和黃色；

27.旗架（=小管）在你桌上左側(cè)墻的位置；

28.你的名牌（置于架子上）。

建議你在開始實(shí)驗(yàn)前閱讀下面的整個(gè)文本，熟悉實(shí)驗(yàn)。

介紹

在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，你將測(cè)試一種名為Pep 的蛋白質(zhì)（在本實(shí)驗(yàn)條件下帶正電荷）與DNA 相互作用的能力。你將獲得待測(cè)DNA，但你必須從粗糙的細(xì)菌裂解液中純化蛋白質(zhì)Pep。在此之前已用質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌，在質(zhì)粒上含有組氨酸標(biāo)記的Pep 編碼基因。通過親和層析進(jìn)行蛋白質(zhì)純化。純化柱中的樹脂上結(jié)合有鎳，組氨酸標(biāo)簽對(duì)鎳具有親和力并與鎳結(jié)合相連。結(jié)合后，通過改變色譜方案中使用的緩沖液，可將蛋白質(zhì)從樹脂上分離。將洗脫的組分分別收集在幾個(gè)管中。你將通過Bradford 方法確定2 個(gè)不同組分中的蛋白質(zhì)濃度。這是比色測(cè)定法，其中考馬斯亮藍(lán)與蛋白質(zhì)的附著導(dǎo)致其在595 nm 波長(zhǎng)處的吸光度增加。通過使用測(cè)定已知濃度的牛血清白蛋白（BSA）溶液得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可確定組分的蛋白質(zhì)濃度。隨后，將通過進(jìn)行凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)測(cè)試其中1 個(gè)組分中的Pep 蛋白與DNA 相互作用的能力。在該實(shí)驗(yàn)中，DNA 與蛋白質(zhì)的相互作用會(huì)延遲電泳期間DNA 在瓊脂糖凝膠上的遷移。

實(shí)驗(yàn)操作流程

A.通過親和層析從細(xì)菌裂解物中純化Pep 蛋白

1.記錄已置于柱支架孔中的色譜柱。此外，還要注意其被緊緊地插入孔中。在實(shí)驗(yàn)過程中，避免將其從孔中移出。柱子的底部是密封的，柱子中的樹脂用少量乙醇覆蓋。仔細(xì)查看色譜柱的內(nèi)容物，以正確檢測(cè)樹脂與上覆液體之間的邊界。

2.打開色譜柱頂部的紅色蓋子，取掉色譜柱底部的微量移液器特殊吸頭（MST），然后快速地將#1 管置于色譜柱下方的管架中，用以收集洗脫的乙醇。收集應(yīng)持續(xù)進(jìn)行，直至樹脂上沒有乙醇。將收集3～4 滴。

3.快速，但輕輕地向柱中加入500 μL 裂解緩沖液，在注入過程中不破壞柱內(nèi)的樹脂，使柱與裂解液LB 平衡。

4.將洗脫液滴收集在#2 管中，直至樹脂上方?jīng)]有緩沖液（收集約500 μL）。

5.快速，但輕輕地將500 μL 細(xì)菌裂解液添加到柱上，并開始在#3 管中收集液滴。確保所有細(xì)菌裂解液都已進(jìn)入柱中（收集約500 μL）。

6.快速，但輕輕地將500 μL 洗滌緩沖液A 并開始在#4 管中收集液滴。隨著樹脂上方緩沖液的體積減少至約100～200 μL，另外添加300 μL 緩沖液A 并繼續(xù)在同一#4 管中收集液滴。繼續(xù)加入3 次300 μL（即柱子應(yīng)用總體積為1.7 mL 的緩沖液A 洗滌）。收集可在#5 管中繼續(xù)（在#4 管和#5 管中總共將收集約1.7 mL）。

7.快速，但輕輕地加入500 μL 緩沖液B 以開始分離與柱中樹脂結(jié)合的Pep 分子。開始在#6、#7 和#8 管中收集液滴。每個(gè)管中應(yīng)收集3 滴。隨著樹脂上方緩沖液的體積減少至約200 μL，另外添加200 μL 的緩沖液B 并繼續(xù)收集洗脫液，直至在#8 管中收集3 滴。

8.快速用微量移液器特殊吸頭（MST）密封色譜柱的底端。這是通過將色譜柱底部插入特殊吸頭的寬口實(shí)現(xiàn)快速密封的。

B.BRADFORD 蛋白質(zhì)分析（這項(xiàng)任務(wù)分為2個(gè)部分）

第1 部分

1.如表1所示準(zhǔn)備牛血清蛋白BSA（=標(biāo)準(zhǔn)蛋白）稀釋液：

表1

2.如表2所示，在#16 管和#17 管中準(zhǔn)備#7 管和#8 管的稀釋液。

表2

3.將#9 管～#17 管每個(gè)管內(nèi)的物質(zhì)進(jìn)行混合。

4.每個(gè)樣品將一式2 份進(jìn)行測(cè)定，分別在96孔板的B 行和D 行。為此，從#9～#15 管中各取出10 μL 分別加入孔B1 ～B7 中，然后再各取10 μL加入D1～D7 孔中。隨后，從#16 管中各取10 μL 分別加入孔B8 和D9 中，從#17 管中各取10 μL 分別加入孔B11 和D11 中。在已加入樣品的每個(gè)孔中分別加入190 μLBradford 試劑。用微量移液器尖輕輕混合，注意不要產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)干擾吸光度測(cè)量。

5.在96 孔板上蓋上蓋子，且用鋁箔包裹板，以防止暴露在光線下。在黑暗中培養(yǎng)應(yīng)持續(xù)5 min（你可在5 min 培養(yǎng)期間開始此任務(wù)的第2 部分）。

6.完成5 min 培養(yǎng)后，將紅旗置于旗架上。實(shí)驗(yàn)監(jiān)考人員會(huì)將你的有編碼的板拿到分光光度計(jì)站，在595 nm 波長(zhǎng)下讀取所有孔的吸光度。吸光度讀數(shù)將用于評(píng)判你的表現(xiàn)。（45 分）

第2 部分

注意：Bradford 測(cè)定第2 部分中的所有數(shù)據(jù)均與考生之前進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)有關(guān)。

1.第1 部分中描述的Bradford 測(cè)定已由考生完成，吸光度讀數(shù)用于繪制下面提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.使用標(biāo)準(zhǔn)曲線和考生獲得的#16 管和#17 管的A595（595 nm 處的吸光度），如下所示，計(jì)算考生的#7 管和#8 管中的組分的蛋白質(zhì)濃度。在答題紙上寫下#7 管和#8 管的蛋白質(zhì)濃度（保留小數(shù)點(diǎn)后2 位數(shù)）。（5 分）

管16：管17：孔B9：0.32孔B11：0.41孔D9：0.34孔D11：0.43

C.凝膠阻滯分析

此測(cè)定將使用#8 管的內(nèi)容物進(jìn)行（=在加入緩沖液B 后收集液滴的第3 個(gè)管）。

1.按照下述步驟稀釋#8 管：在#18 管中加入10 μL #8 管的物質(zhì)和40 μL PBS，并且混合。

2.#19～#25 管應(yīng)按下表3所述制備。按所述順序添加（從上到下）。

表3

3.將DNase 加入#24 管 和#25 管，3 min 后 向#19～#25 管中各加入3 μL 凝膠上樣染料并混合。

4.此時(shí)凝膠電泳儀器將被關(guān)閉。小心不要按設(shè)備上的電源按鈕或任何其他按鈕。將#19～#25管各取15 μL 連續(xù)加入到電泳裝置中瓊脂糖凝膠的7 個(gè)相鄰孔（當(dāng)正極朝向你時(shí)從左到右）中。在第8 個(gè)孔中加入15 μL 已含有凝膠上樣染料的DNA 大小標(biāo)記物。注意：凝膠用電泳緩沖液覆蓋，因此，將15 μL 等分試樣非常溫和地加到每個(gè)孔的底部，以防止在上樣時(shí)溢出。

注意：凝膠的1 個(gè)孔留空。

5.上樣完成后，將橙色照片罩插入設(shè)備。按下設(shè)備右下表面的電源按鈕開始電泳。記錄電泳開始的時(shí)間。右上方的2 個(gè)按鈕用于高水平或低水平藍(lán)色照明。按下按鈕進(jìn)行高水平照明。這將使你能在電泳過程中實(shí)時(shí)顯示凝膠中DNA的遷移，因?yàn)镈NA 結(jié)合染色劑已在凝膠中。DNA遷移可通過照片罩頂部的孔觀察。觀察過程中不應(yīng)移除照片罩。

6.開始電泳15 min 后，按電源按鈕斷開電源。將你的綠旗置于旗架上，提醒監(jiān)考人員注意。他/她將通過照片罩的孔拍攝凝膠照片（35 分）。你可在15 min 的時(shí)間間隔內(nèi)進(jìn)行下面的理論問題。

問題（總共15 分）：

在答題紙中用“×”表示以下每個(gè)陳述的正確或錯(cuò)誤。

1.蛋白質(zhì)測(cè)定的線性范圍越大，需要對(duì)測(cè)定中使用的目標(biāo)樣品濃度的關(guān)注越少（1 分）。

2.Pep 對(duì)質(zhì)粒DNA 上DNase 活性的影響可能是依賴于這段DNA 的序列的（1 分）。

3.在孔上方的凝膠區(qū)域中對(duì)染色的DNA 的觀察將反映DNA 與高濃度Pep 相互作用的結(jié)果（1分）。

4.假設(shè)下面所示的示意圖代表管#19 的內(nèi)容物的電泳圖?？拷厦娴哪菞l帶可能是環(huán)狀質(zhì)粒DNA，其中1 條鏈中的1 個(gè)磷酸二酯鍵已斷開（1 分）。

5.學(xué)生A 試圖純化一個(gè)質(zhì)粒，學(xué)生B 試圖純化另一個(gè)質(zhì)粒。2 種質(zhì)粒都沒有重復(fù)序列。在質(zhì)粒電泳后，2 位學(xué)生觀察到如下所示2 個(gè)條帶?；谝阎馁|(zhì)粒大小，上部條帶是出乎意料的。每個(gè)限制性酶消化質(zhì)粒制備物都是按照完全消化進(jìn)行的，隨后對(duì)消化產(chǎn)物進(jìn)行電泳。結(jié)果如下所示。質(zhì)粒圖譜顯示每個(gè)質(zhì)粒僅含有1 個(gè)所用酶的識(shí)別位點(diǎn)。

在答題紙中指出以下每個(gè)陳述是正確的還是錯(cuò)誤的（4 分）。

a.學(xué)生A 的意外條帶可能是線性化的質(zhì)粒DNA

b.學(xué)生B 的意外條帶可能是環(huán)狀二聚體質(zhì)粒DNA

c.用同樣的限制酶部分消化學(xué)生A 的質(zhì)粒制備物，跑出的電泳模式將預(yù)期產(chǎn)生至多3 個(gè)條帶

d.用同樣的限制酶部分消化學(xué)生B 的質(zhì)粒制備物，跑出的電泳模式將預(yù)期產(chǎn)生3 個(gè)條帶

6.為了確定一段目標(biāo)線性DNA 分子的2 種稀有限制酶（RE1 和RE2）的限制酶圖譜，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。首先，標(biāo)記DNA 分子的樣品5’末端，分別用RE1 和RE2 切割。被標(biāo)記的片段產(chǎn)物的長(zhǎng)度如下圖中星號(hào)所示。其他未被標(biāo)記的DNA 樣品也分別用RE1 和RE2 切割。將RE1 消化產(chǎn)物上樣到非常寬的凝膠孔中并電泳。電泳后，通過Southern印跡將凝膠上的DNA 條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾紙上。將RE2 消化產(chǎn)物上樣到另一個(gè)凝膠的非常寬的孔中并進(jìn)行電泳，然后通過Southern 印跡將該凝膠上的DNA 條帶轉(zhuǎn)移至同樣的含有RE1消化產(chǎn)物的硝酸纖維素濾紙上，但此轉(zhuǎn)移相對(duì)于RE1 限制性片段的轉(zhuǎn)移是垂直方向的。圓圈顯示RE1 降解片段和RE2 降解片段之間雜交的位置。

指出以下每個(gè)陳述的正確或錯(cuò)誤（7 分）。

a.用RE1 和RE2 完全消化DNA 分子將產(chǎn)生11 個(gè)片段

b.通過用RE1消化產(chǎn)生的6.4×102bp和7.3×102bp DNA 片段在未消化的DNA 分子中相鄰

c.分別通過RE1 和RE2 消化產(chǎn)生的5.6×102bp和4.8×102bp 片段在未消化的DNA 分子中是重疊的

d.分別通過RE1和RE2消化產(chǎn)生的17.5×102bp和21.9×102bp 片段在未消化的DNA 分子中重疊

e.2 種限制酶中，其中一種限制酶的任何消化產(chǎn)物都不會(huì)與另一種酶的3 種消化產(chǎn)物重疊

（待續(xù)）