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    一株嗜鹽脫硫菌的篩選及其脫硫特性的研究*

    2021-03-25 02:28:52張海林秦子臻邢壯壯葛大艷張玉然
    生物學(xué)通報(bào) 2021年6期
    關(guān)鍵詞:堿法單質(zhì)控制策略

    張海林 秦子臻 邢壯壯 葛大艷 李 柳 張 然 張玉然

    (濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)學(xué)院 山東日照 276826)

    隨著環(huán)保要求的不斷提高,作為清潔能源的生物質(zhì)氣體(沼氣、天然氣、填埋氣等)備受人們青睞。而生物質(zhì)氣體中常含有不同濃度的H2S 氣體(1~12 g/m3)[1]。酸性的H2S 氣體容易腐蝕輸送管道、燃燒設(shè)備及發(fā)電裝置,燃燒后亦會(huì)產(chǎn)生污染性的酸性氣體SO2,因此,在利用之前須被脫除。

    去除H2S 的方法主要有化學(xué)法和生物法。生物法工藝因具有運(yùn)行條件溫和、去除H2S 效率高、運(yùn)行成本低,不產(chǎn)生二次污染等優(yōu)點(diǎn)[2-3],被廣泛應(yīng)用于生物質(zhì)氣體脫硫領(lǐng)域中。在眾多的生物脫硫工藝中,Shell-Paques 堿法生物脫硫工藝具有運(yùn)行性能穩(wěn)定、較強(qiáng)的抗H2S 負(fù)荷沖擊力等特點(diǎn)[4],被大量應(yīng)用于沼氣脫硫領(lǐng)域。Shell-Paques堿法工藝為分段式,在吸收塔內(nèi)利用堿性液體吸收生物質(zhì)氣體中的H2S,而后在反應(yīng)器中進(jìn)行生物氧化,同時(shí)完成堿性液體再生,整個(gè)過程周而復(fù)始連續(xù)進(jìn)行,終產(chǎn)物主要為單質(zhì)硫,并伴有副產(chǎn)物S2O32-和SO42-的生成。系統(tǒng)運(yùn)行過程中,堿性液體的堿度基本維持恒定,而酸性副產(chǎn)物的積累常會(huì)導(dǎo)致體系中鈉鹽濃度升高,而當(dāng)Na+離子濃度達(dá)到0.85 mol/L 時(shí),S2-去除速度顯著被抑制。為了降低Na+離子濃度,需大量更換反應(yīng)器中的堿性液體,浪費(fèi)大量液堿,增加脫硫成本。因此,篩選嗜鹽性強(qiáng)、脫硫性能優(yōu)越的菌株勢(shì)在必行。

    本研究擬從曬鹽場(chǎng)污泥里篩選1 株嗜鹽脫硫菌株,并通過分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定,而后對(duì)其Na+濃度耐受性、最佳環(huán)境pH 值和溫度進(jìn)行探索,最后,比較了以氧化還原電位和溶解氧為過程控制指標(biāo)時(shí)的脫硫效果,為解決堿法生物脫硫工藝中堿耗過高的問題提供理論研究基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1)菌株篩選樣品來源:中國壽光?;瘓F(tuán)鹵水曬鹽場(chǎng)底層10~20 cm 處污泥。

    2)培養(yǎng)基:

    液體富集培養(yǎng)基:NaHCO350 g/L、Na2S2O3·5H2O 50 g/L、(NH4)2SO41 g/L、KNO31 g/L、K2HPO42 g/L、自然pH 值。

    高鹽篩選培養(yǎng)基:NaHCO350 g/L、Na2S2O3·5H2O 50 g/L、(NH4)2SO41 g/L、KNO31 g/L、K2HPO42 g/L、Na2SO450 g/L、瓊脂20 g/L、自然pH 值。

    基礎(chǔ)培養(yǎng)基:NaHCO350 g/L、(NH4)2SO41 g/L、KNO31 g/L、K2HPO42 g/L、自然pH 值。

    3)儀器與試劑:PCR 儀S1000(美國伯樂公司)、Gel Doc EZ Imager(美國伯樂公司)、Eppendorf BioFlo 7.5 L 發(fā)酵罐、細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒(上海生工)等。

    1.2 方法

    1)液體富集培養(yǎng):取曬鹽場(chǎng)污泥,按重量比1∶3 加無菌水懸浮,無菌脫脂棉過濾,過濾液在8 000 r/min,離心5 min,將沉淀物轉(zhuǎn)移至液體富集培養(yǎng)基中,36℃、200 r/min 震蕩培養(yǎng)2 d。

    2)嗜鹽脫硫菌的篩選:富集菌液稀釋適當(dāng)比例,涂布于高鹽篩選培養(yǎng)基,36℃培養(yǎng)3~7 d,挑選菌落較大、菌落周邊有明顯單質(zhì)硫沉積的菌株,并將其命名為ZTLH 菌株。

    3)脫硫菌種的分子生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建:參照文獻(xiàn)方法[5],對(duì)16S rDNA 進(jìn)行擴(kuò)增,并送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,使用MEGA 7.0 軟件同源比對(duì),并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

    4)Na+濃度對(duì)ZTLH 菌株去除S2-速度的影響:向含有90 mmol/L Na2S 的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加固體Na2SO4,至Na+離子濃度分別為1.0 mol/L、1.2 mol/L、1.4 mol/L、1.6 mol/L、1.8 mol/L、2.0 mol/L,將富集培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 的菌體離心、接種于該培養(yǎng)基中,36℃、200 r/min 震蕩培養(yǎng)12 h,間隔1 h 取樣測(cè)定S2-殘留量,以未加脫硫菌種的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對(duì)照。

    5)環(huán)境pH 值對(duì)H.kellyZTLH 菌株去除S2-速度的影響:將菌種接種于不同pH 值(8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5)的含有90 mmol/L Na2S 的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(Na+為1.8 mol/L),36℃、200 r/min 震蕩培養(yǎng)12 h,間隔1 h 取樣,測(cè)定S2-殘留量。

    6)環(huán)境溫度對(duì)ZTLH 菌株去除S2-速度的影響:將菌種接種于含有90 mmol/L Na2S 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(Na+為1.8 mol/L,pH=9.0),于不同溫度(30℃、33℃、36℃、39℃、42℃、45℃),200 r/min 震蕩培養(yǎng)12 h,間隔1 h 取樣,測(cè)定S2-殘留量。

    7)DO/ORP 控制策略對(duì)ZTLH 菌株脫硫性能的影響:將菌種接種于液體富集培養(yǎng)基中(共計(jì)4 L),36℃、200 r/min 震蕩培養(yǎng)24 h,離心獲得菌體,并接種于4 L 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(含Na+1.8 mol/L)。在7.5 L eppendoff 發(fā)酵罐內(nèi),通風(fēng)比1∶1(v/v),39℃條件下,根據(jù)溶解氧(DO)、氧化還原電位(ORP)控制參數(shù)值,調(diào)控Na2S 的流加速度,每次實(shí)驗(yàn)周期為72 h,測(cè)定反應(yīng)體系內(nèi)S2-、S、S2O32-、SO42-等離子含量。

    8)分析方法:S2-離子分析方法采用碘量法;SO42-離子分析方法采用鉻酸鋇比色法[6];S2O32-離子分析方法采用紫外分光光度法[7];單質(zhì)硫分析方法采用稱重法和質(zhì)量守恒法[6]。

    2 結(jié)果和分析

    2.1 嗜鹽脫硫菌篩選及分子生物學(xué)鑒定 從?;瘓F(tuán)鹵水曬鹽場(chǎng)污泥中篩選出1 株嗜鹽脫硫菌株ZTLH,經(jīng)平板培養(yǎng)后,菌落周圍有明顯單質(zhì)硫沉積,且顏色由白色逐漸變?yōu)楹稚?。利用通用引物擴(kuò)增其16S rDNA 序列,并進(jìn)行測(cè)序分析,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,結(jié)果如圖1所示。菌株ZTLH 與Halothiobactllus kellystrain BII-1 親緣關(guān)系較近,聚成一支,結(jié)合NCBI 數(shù)據(jù)庫顯示與其相似度高達(dá)99.0%,進(jìn)一步將該菌株命名為Halothiobactllus kellyZTLH。

    圖1 H.kelly ZTLH 菌株16S rDNA 序列PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖(a)和構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(b)

    2.2 Na+濃度對(duì)菌株H.kellyZTLH 脫硫速度的影響 在不同濃度Na+條件下,研究其對(duì)H.kellyZTLH 脫除S2-速度的影響,結(jié)果如圖2所示。當(dāng)培養(yǎng)基中Na+濃度低于1.8 mol/L 時(shí),均不影響H.kellyZTLH 對(duì)S2-的脫除率。與已報(bào)道的脫硫微生物在0.85 mol/L Na+濃度下,S2-去除速度即會(huì)顯著下降[6,8]相比,H.kellyZTLH 具有優(yōu)良的Na+耐受性。

    圖2 Na+濃度對(duì)H.kelly ZTLH 菌株去除S2-速度的影響

    2.4 環(huán)境pH 對(duì)H.kellyZTLH 菌株脫硫速度的影響 調(diào)整不同的環(huán)境pH 值,研究其對(duì)H.kellyZTLH 菌株去除S2-速度的影響,結(jié)果如圖3所示。培養(yǎng)基pH 值低于10.5 時(shí),均不影響H.kellyZTLH對(duì)S2-的脫除率,而環(huán)境pH 值高于11.0 時(shí),S2-去除速度受到明顯抑制。H.kellyZTLH 具有高濃度Na+耐受性同時(shí),亦可耐受較高的環(huán)境pH 值。

    圖3 環(huán)境pH 值對(duì)H.kelly ZTLH 菌株去除S2-速度的影響

    2.5 環(huán)境溫度對(duì)ZTLH 菌株脫硫速度的影響 調(diào)整不同的培養(yǎng)環(huán)境溫度,研究其對(duì)H.KellyZTLH菌株代謝S2-速度的影響,結(jié)果如圖4所示。H.kellyZTLH 菌株最適培養(yǎng)溫度為36~39℃。過低(33℃以下)或過高的環(huán)境溫度(42℃以上)均會(huì)降低去除S2-的速度。

    圖4 溫度對(duì)H.kelly ZTLH 菌株去除S2-速度的影響

    2.6 DO/ORP 控制策略對(duì)脫硫性能的影響 在減法生物脫硫工藝中,S2-被脫硫微生物氧化后的產(chǎn)物一般為S、S2O32-、SO42-。S 在總硫中的占比,是決定脫硫運(yùn)行成本的關(guān)鍵因素。溶解氧(DO)、氧化還原電位(ORP)是影響代謝產(chǎn)物成分的關(guān)鍵控制參數(shù)。按1.2.方法7 中所述方法,研究其對(duì)H.kellyZTLH 菌株去除S2-速度及脫硫產(chǎn)物的影響。

    當(dāng)DO 濃度從0.5 mg/L 提高至1.5 mg/L 時(shí),S2-去除速度由12.5 mmol/(L·h)增加至25.2 mmol/(L·h),而單質(zhì)硫生成比例卻由93.4%下降至75.3%,同時(shí)、SO42-生成比例分別增加了3 倍和10 倍(圖5)。當(dāng)DO 濃度高于1.0 mg/L 時(shí),S2-去除速度小幅度提高,而單質(zhì)硫生成比例卻大幅降低。為了獲得較高的單質(zhì)硫生成比例,DO 濃度應(yīng)控制在1.0 mg/L 以內(nèi)。

    圖5 溶解氧(DO)對(duì)H.kelly ZTLH 菌株去除S2-速度及脫硫產(chǎn)物的影響

    在ORP 控制策略中,隨著ORP 值的降低,S2-去除速度由26.1 mmol(/L·h)降低至19.5 mmol(/L·h),降低幅度較小,而單質(zhì)硫生成比例由80.4%大幅升高至93.5%,同時(shí)S2O32-、SO42-生成比例都分別減少了2 倍(圖6)。ORP 控制值對(duì)S2-去除速度影響較小,而對(duì)單質(zhì)硫生成比例影響較大,最佳ORP控制范圍為-380~-375 mV。

    脫硫微生物氧化低價(jià)硫元素(S2-)過程中,普遍同時(shí)存在氧化產(chǎn)物為單質(zhì)硫的輔酶Q 途徑和氧化產(chǎn)物為S2O32-、SO42-的細(xì)胞色素途徑[9-10]。這2 種途徑分別受到細(xì)胞內(nèi)的能荷量、氧濃度、S2-濃度調(diào)節(jié)[11]。較高的細(xì)胞內(nèi)氧濃度能激活細(xì)胞色素途徑相關(guān)酶活性,導(dǎo)致較多的S2-過度氧化至S2O32-、乃至SO42-;而較高的細(xì)胞內(nèi)S2-濃度能抑制細(xì)胞色素途徑相關(guān)酶活性[12],激發(fā)輔酶Q 途徑,S2-被有限地被氧化至單質(zhì)硫。對(duì)于H.kellyZTLH 菌株,ORP 控制策略明顯優(yōu)于DO 控制策略,這可能與ORP 控制方式下,溶液中較高的S2-濃度部分抑制細(xì)胞色素途徑有關(guān)。

    3 結(jié)論

    本文通過高鹽篩選培養(yǎng)基篩選,獲得一株嗜鹽性能優(yōu)良的脫硫菌株,經(jīng)序列比對(duì)和進(jìn)化樹綜合分析,鑒定屬于Halothiobactllus kelly菌屬。H.kellyZTLH 菌株能耐受1.8 mol/L Na+極端環(huán)境,并在高鹽環(huán)境下S2-去除速度達(dá)到20~25 mmol/(L·h)。相比于DO 控制策略,在ORP 控制方式下,脫硫產(chǎn)物中單質(zhì)硫占比可達(dá)93.5%。H.kellyZTLH 菌株具有較高的S2-去除速度,有助于縮小堿法生物脫硫工藝中體積較大的反應(yīng)器體積;良好的耐鹽性能和脫硫產(chǎn)物中單質(zhì)硫占比,有助于解決目前堿法生物脫硫工藝中存在的堿耗過高和易染雜菌的問題。

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