“大紅袍揮發(fā)油中檸檬烯含量測(cè)定”簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)教學(xué)*

解子儀 劉芯瑩 寧安琪 逯佩玉 邵亞洲 梁俊玉

（西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 甘肅蘭州 730070）

大紅袍（Zanthoxylum bungeanumMaxim）為花椒屬植物的一種，揮發(fā)油含量豐富[1]。大紅袍揮發(fā)油中存在一種主要成分——檸檬烯（limonene），氣味類(lèi)似檸檬的香味，功能眾多，包括抗菌抑菌、殺蟲(chóng)殺螨、防腐保鮮等。檸檬烯在食品藥品、日化領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[2-3]。本實(shí)驗(yàn)以甘肅省隴南市產(chǎn)的大紅袍為材料，提取大紅袍揮發(fā)油，測(cè)定揮發(fā)油中檸檬烯的百分含量。通過(guò)分析實(shí)驗(yàn)難點(diǎn)，調(diào)整實(shí)驗(yàn)方案，使實(shí)驗(yàn)各個(gè)操作環(huán)節(jié)安全可控，學(xué)生只要以嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度，認(rèn)真仔細(xì)操作每一步驟，易獲得可靠結(jié)果，適合作為中職院校的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

1 探究實(shí)驗(yàn)難點(diǎn)

在實(shí)驗(yàn)?zāi)康纳希鄶?shù)文獻(xiàn)為探究檸檬烯在大紅袍中的百分含量。以文獻(xiàn)《基于GC-MS技術(shù)對(duì)甘肅隴南大紅花椒揮發(fā)油檸檬烯芳樟醇含量的測(cè)定》和《花椒揮發(fā)油的提取及其抑菌抗蟲(chóng)活性測(cè)定》為例[4-5]。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容存在難點(diǎn)：1）需選用不同溶劑提取大紅袍揮發(fā)油，并比較揮發(fā)油顏色、狀態(tài)、氣味；2）分別計(jì)算大紅袍揮發(fā)油的提取率；3）選擇呈黃色透明油狀有單純花椒氣味，且提取率高的溶劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。但由于中職學(xué)生較難把握判斷標(biāo)準(zhǔn)，且實(shí)驗(yàn)時(shí)間有限，故實(shí)驗(yàn)不易于實(shí)施。

2 簡(jiǎn)化方案及效果

筆者嘗試調(diào)整實(shí)驗(yàn)思路，明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑椤疤骄繖幟氏┰诖蠹t袍揮發(fā)油中的百分含量”。學(xué)生只需完成3個(gè)環(huán)節(jié)，即大紅袍揮發(fā)油的提取、氣質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定檸檬烯含量、歸一化法確定檸檬烯百分含量。首先，測(cè)定檸檬烯的含量是相對(duì)揮發(fā)油的含量而言，無(wú)需計(jì)算大紅袍的提油率；其次，采用水蒸氣蒸餾法提取大紅袍揮發(fā)油，不涉及對(duì)多種提取溶劑的比較。簡(jiǎn)化后的實(shí)驗(yàn)要求，符合中職學(xué)生的實(shí)際操作能力，易于在生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課堂實(shí)施。

2.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過(guò)查閱資料，展開(kāi)合作探究性學(xué)習(xí)，使學(xué)生理解提取揮發(fā)油的原理，掌握提取揮發(fā)油的操作方法和注意事項(xiàng)；學(xué)會(huì)使用氣質(zhì)聯(lián)用儀等實(shí)驗(yàn)設(shè)備；并對(duì)實(shí)驗(yàn)課堂產(chǎn)生興趣，對(duì)大紅袍有效成分的藥用價(jià)值產(chǎn)生研究熱情。

2.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1）試劑：乙醚、正己烷、檸檬烯標(biāo)準(zhǔn)品（20 mg）、蒸餾水。

2）儀器：氣質(zhì)聯(lián)用儀、微孔濾膜、20 目分選篩子、粉碎機(jī)、濾紙、揮發(fā)油提取器、圓底燒瓶、錐形瓶、容量瓶、冷凝管、紗布、沸石、電熱套。

3）材料準(zhǔn)備：選用產(chǎn)自甘肅隴南的大紅袍干燥的果皮。稱(chēng)取大紅袍樣品100 g 粉碎，過(guò)20 目篩，裝入2 000 mL 的圓底燒瓶中，加800 mL 蒸餾水及沸石，浸泡過(guò)夜。

2.3 實(shí)驗(yàn)流程

1）標(biāo)準(zhǔn)品制備[6]：精密稱(chēng)取20 mg 檸檬烯，置于5 mL容量瓶中，用正己烷定容，即得檸檬烯標(biāo)準(zhǔn)品。

2）揮發(fā)油提取：如圖1所示，搭建提取揮發(fā)油裝置。在揮發(fā)油測(cè)定器中加入蒸餾水至溢流入圓底燒瓶中，電熱套上加熱圓底燒瓶，溫度為120℃，蒸餾4 h，冷卻。從揮發(fā)油測(cè)定器中放出所提取的大紅袍揮發(fā)油，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，加少許乙醚萃取并過(guò)濾，常溫下?lián)]干乙醚，得芳香油，為黃色且有特殊香味。取揮發(fā)油30 μL，加正己烷定容至10 mL，再用微孔濾膜過(guò)濾，即得檸檬烯供試品[7]。

圖1 大紅袍揮發(fā)油提取裝置

3）氣質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定[8]：①測(cè)定前：設(shè)置氦氣壓力為0.5 MPa，流速為1.0 mL/min。②測(cè)定時(shí)：色譜條件，初始溫度60℃，程序升溫，從10℃/min 速率升至180℃；待1 min 后，以20℃/min 升至280℃，保持5 min；進(jìn)樣量1 μL（用正己烷稀釋至1%），分流比為10∶1 進(jìn)樣；汽化室溫度為250℃；質(zhì)譜條件，電壓70 eV，溫度230℃; 掃描范圍20～200 m/z。③測(cè)定后：數(shù)據(jù)比較NIST 和WILEY 庫(kù)及文獻(xiàn)中記錄的化合物進(jìn)行鑒定，得出檸檬烯的含量。

4）標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：精密吸取上述對(duì)照品母液加正己烷稀釋?zhuān)孟盗袧舛忍荻取０瓷鲜錾V條件分別進(jìn)樣，以進(jìn)樣量對(duì)峰面積積分值進(jìn)行回歸處理，得檸檬烯標(biāo)準(zhǔn)曲線。檸檬烯回歸方程為y=（5×108）x-2×107，R2=0.9996。

2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 本次實(shí)驗(yàn)將20 人分為3 組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均較好且差異不大，以其中一組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。圖2為大紅袍揮發(fā)油TIC（total ions chromatograph）,即總離子流圖，由圖可知，大紅袍揮發(fā)油的分離正確；圖3和圖4為質(zhì)譜與NIST 和WILEY 對(duì)照，通過(guò)與檸檬烯標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，確定大紅袍揮發(fā)油中含有檸檬烯的成分。

圖2 大紅袍揮發(fā)油總離子流圖

圖3 檸檬烯標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖

圖4 檸檬烯樣品質(zhì)譜圖

表1為3 個(gè)小組的數(shù)據(jù)匯總，通過(guò)歸一化法，根據(jù)氣相色譜峰面積，確定檸檬烯在揮發(fā)油中的含量。從計(jì)算的數(shù)據(jù)分析，3 組學(xué)生操作得當(dāng)。最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為，甘肅隴南大紅袍揮發(fā)油中檸檬烯含量為24.95%。

表1 大紅袍揮發(fā)油中檸檬烯的含量

2.5 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1）揮發(fā)油提?。弘姛崽捉佑|的玻璃器皿應(yīng)保持干燥，否則電熱套易短路；冷凝水流速適中，以不燙手為原則；冷凝管要“下管進(jìn)水、上管出水”。

2）檸檬烯測(cè)定：注射器每次進(jìn)樣后要及時(shí)清洗，并擦干針頭；進(jìn)樣保持進(jìn)針豎直，進(jìn)入后快進(jìn)快出。

3 反思

3.1 注重學(xué)生現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)水平，合理設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行，依靠教師對(duì)實(shí)驗(yàn)方案的精心設(shè)計(jì)，而學(xué)生現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)水平，則是教師展開(kāi)教學(xué)設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)。目前，中職學(xué)生操作的獨(dú)立性和實(shí)踐的創(chuàng)新性不強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)較薄弱。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)調(diào)整實(shí)驗(yàn)思路，明確“探究檸檬烯占大紅袍揮發(fā)油的百分含量”為實(shí)驗(yàn)?zāi)康模珳p實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，減少操作環(huán)節(jié)，適合學(xué)生以合作探究的方式完成實(shí)驗(yàn)，增強(qiáng)學(xué)習(xí)興趣與信心。

3.2 教師適時(shí)引導(dǎo)，培養(yǎng)學(xué)生思考能力 思考能力與實(shí)驗(yàn)?zāi)芰γ芮邢嚓P(guān)，做實(shí)驗(yàn)應(yīng)手腦并用，不假思索的機(jī)械操作將無(wú)法提高實(shí)驗(yàn)水平，思考能力制約著學(xué)生實(shí)驗(yàn)水平的發(fā)展，在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中“如何培養(yǎng)學(xué)生的獨(dú)立思考能力”是每一位生物學(xué)教師必須思考的問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)中，教師多次提出問(wèn)題，引導(dǎo)學(xué)生思考，鼓勵(lì)學(xué)生自己找尋答案，例如，在提取大紅袍揮發(fā)油時(shí)，教師展示2 種揮發(fā)油提取裝置，并提問(wèn)哪個(gè)裝置適于本實(shí)驗(yàn)？由學(xué)生思考后給出答案，教師再針對(duì)學(xué)生回答情況進(jìn)行總結(jié)，逐步培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立思考的習(xí)慣。

3.3 培養(yǎng)學(xué)生科學(xué)素養(yǎng)，提升實(shí)驗(yàn)教學(xué)價(jià)值 生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)具有直觀性、實(shí)踐性和激發(fā)性，是培養(yǎng)學(xué)生科學(xué)素養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)之一。實(shí)驗(yàn)前，學(xué)生能直觀感受大紅袍的結(jié)構(gòu)特征，以此豐富感性知識(shí)；實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，學(xué)生親身實(shí)踐，鍛煉自身實(shí)驗(yàn)操作能力；實(shí)驗(yàn)后，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析，學(xué)生了解大紅袍所具有的研究?jī)r(jià)值，進(jìn)而激發(fā)學(xué)生對(duì)植物源中單體成分的研究興趣，提高動(dòng)手能力和解決問(wèn)題的能力，培養(yǎng)學(xué)生的生物學(xué)科學(xué)素養(yǎng)。