Alcalase蛋白酶酶解大豆蛋白制備啤酒糖漿復配液的研究

羅建勇，吳晨孛，黃雋光，周泓江，錢 芳,，郭 峰，黃立新

(1.廣州雙橋股份有限公司，廣州 510280； 2.華南理工大學 食品科學與工程學院，廣州 510640)

啤酒是世界上產(chǎn)量最大、酒精含量低、營養(yǎng)價值豐富的酒種。2002年我國的啤酒產(chǎn)量為2 386.83萬t，開始超過美國成為世界第一[1-2]，之后我國的啤酒產(chǎn)量就一直穩(wěn)居世界前列。2000年前，我國的啤酒企業(yè)以大麥為主要原料、大米為輔料生產(chǎn)淡爽型等各式啤酒。隨著啤酒行業(yè)的快速發(fā)展，產(chǎn)量逐年攀升，對大麥、大米的需求量日益增加，價格大幅上揚。2002年以來，進口大麥不但價格漲幅大，而且質量不穩(wěn)定，給國內(nèi)啤酒行業(yè)帶來很大影響[2]。許多廠家開始試驗使用啤酒用糖漿作為啤酒的輔料，達到縮短釀造周期、提高原料利用率、降低生產(chǎn)成本、擴大產(chǎn)能等目的，為啤酒和淀粉糖行業(yè)帶來了較好的經(jīng)濟效益。

由玉米淀粉或木薯淀粉經(jīng)酶法制備的啤酒用糖漿，含有麥芽糖、單糖組分，適于啤酒釀造。然而，這類淀粉糖漿主要為碳源物質，添加過多造成體系氮源偏少，對啤酒釀造及其產(chǎn)品品質產(chǎn)生不利影響。對于啤酒麥汁的含氮物質，不僅有含量要求，而且對其分子大小有要求，由此Lundin提出了A、B、C區(qū)分法，又稱為蛋白質的隆丁(Lundin)區(qū)分法[3]。隆丁區(qū)分一般要求高分子含氮物質占25%，中分子含氮物質占15%，低分子含氮物質占60%，在此條件下較有利于酵母發(fā)酵和形成啤酒良好的風味和泡沫[3～5]。大豆蛋白含氮量高、產(chǎn)量大、來源廣，為重要的食品原料,但其相對分子質量大，80%以上的蛋白質相對分子質量大于10萬Da，如果要將其添加到淀粉糖漿中用于啤酒發(fā)酵，需要進一步水解，達到啤酒對氮源物質Lundin區(qū)分的分布要求。

Alcalase蛋白酶屬于微生物蛋白酶，酶解蛋白質的效果好，是一種較為理想的酶制劑[6-10]。在企業(yè)開發(fā)啤酒用糖漿的基礎上，本文采用Alcalase蛋白酶在不同的酶解條件下酶解大豆蛋白，研究測定其大豆蛋白酶解液的蛋白質回收率、水解度、Lundin區(qū)分的變化及其SDS-PAGE凝膠電泳特性，探討酶解制備大豆蛋白酶解液的條件，以期與啤酒用糖漿復配使用更適于啤酒的發(fā)酵。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大豆蛋白，山東香馳豆業(yè)科技有限公司；Alcalase堿性蛋白酶(酶活力2.4 AU/g)，諾維信公司。三氯乙酸、高嶺土、濃硫酸、濃鹽酸等為分析純，無水碳酸鈉、鄰苯二甲酸氫鉀為基準純，L-酪氨酸、甘氨酸、干酪素為生化試劑，丙烯酰氨、N，N′-甲叉雙丙烯酰氨、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、四甲基乙二胺(TEMED)、考馬斯亮藍R-250、十二烷基硫酸鈉和電泳標準蛋白樣品均為電泳純。

PHS-3C型pH計，F(xiàn)A1004電子分析天平，KHW-D-1電熱恒溫水浴渦，79-3型恒溫磁力攪拌器，JJ-1增力電動攪拌器，KDN-2C型凱氏定氮儀，KDN型消化爐，TDL-5-A型低速臺式離心機，DYCG-30型電泳槽。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆蛋白酶解液制備

準確稱取一定量的大豆蛋白，加入一定量蒸餾水，攪拌均勻，在(80±2)℃處理15 min，冷卻至預定溫度后恒溫水浴，調節(jié)pH至設定值。加入一定量的酶粉(液)，配制成設定底物質量分數(shù)的反應液，緩慢攪拌，反應過程用0.5 mol/L NaOH溶液滴定維持體系在預定的pH。反應到預定時間后，立即放入85℃或100℃水浴中加熱15 min鈍化蛋白酶，冷卻后在4 800 r/min下離心20 min，取上清液，于冰箱冷藏。采用pH-state法測定大豆蛋白酶解過程的水解度[11]。

1.2.2 干固物含量的測定

采用常壓干燥法[12]測定。

1.2.3 蛋白質含量的測定

參照GB 5009.5—2016的方法測定，換算系數(shù)為5.71。

1.2.4 蛋白質回收率的計算

大豆蛋白酶解后，計量酶解離心后上清液的質量。準確稱取約1.000 g的蛋白酶解液，用凱氏定氮法消化、定氮，測定上清液中蛋白質含量，按下式計算蛋白質回收率。

1.2.5 隆丁區(qū)分[13]

高分子含氮物質在酸性溶液中易被單寧所沉淀，磷鉬酸可同時沉淀高、中分子含氮物質。低分子含氮物質則不為上述試劑所沉淀。因此，將樣品用硫酸酸化后，加單寧使高分子含氮物質沉淀，測定濾液的含氮量，從總氮中減去此值即可得到高分子含氮物質的含氮量(A區(qū)分)。另一份樣品用磷鉬酸沉淀，測定濾液中的含氮量，即為低分子含氮物質的含氮量(C區(qū)分)。用單寧沉淀高分子含氮物質后的濾液含氮量減去低分子含氮物質的含氮量，即為中分子物質的含氮量(B區(qū)分)。

1.2.6 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析[14]

標準蛋白樣品和分析樣品在同一塊凝膠上進行電泳，用標準蛋白的遷移率與相對分子質量的對數(shù)作圖，可以獲得一條標準曲線，根據(jù)未知蛋白的遷移率，可得到未知樣品的相對分子質量。

2 結果與討論

2.1 酶量對大豆蛋白酶解產(chǎn)物的影響

底物質量分數(shù)5%，酶解溫度55℃，pH 8.0，分別在500、750 U/g和1 000 U/g的酶量下進行酶解，隨著酶解的進行，體系pH逐漸下降，過程滴加0.5 mol/L的NaOH保持pH為8.0。取不同時間段的酶解液測量其蛋白質回收率和水解度、酶解液Lundin分布以及電泳后的相對分子質量分布，結果見圖1～圖3。

由圖1可見，隨著酶量的增加，蛋白質回收率不斷增大，大分子蛋白不斷被酶解成相對分子質量較小的蛋白質和多肽。反應2 h時，蛋白質回收率接近峰值；此后隨著時間延長，蛋白質回收率有所減小。該酶解是一個較復雜的變化過程，在大分子蛋白被酶解成小分子蛋白和多肽的同時，這些小分子蛋白和多肽也能夠經(jīng)過相互作用，再次聚集成相對分子質量稍大的蛋白質，使得體系的蛋白質回收率有所降低。隨著酶量的增加和酶解時間的延長，大豆蛋白水解度呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。在水解初期的30～40 min內(nèi)，水解速率與酶量呈正相關，水解度上升很快；1 h后水解度上升速度逐漸放緩，至2 h以后水解度趨于一個極限穩(wěn)定值；不同的酶量，其極限值不同，與酶量呈正相關。

注：1.標準蛋白樣品；2.反應0.5 h樣品；3.反應1 h樣品；4.反應1.5 h樣品；5.反應2 h樣品。下同。

由圖2可見：隨著酶量增加和酶解時間的延長，C區(qū)分的含量最大，占比超過60%，且變化較小；A區(qū)分的變化最為顯著，含量在20%以下，顯示大分子的蛋白質被酶解的最多。尤其在較高的酶量下，A區(qū)分含量隨酶解的進行，下降明顯；B區(qū)分的含量總體呈下降趨勢，當酶量為750 U/g時，1 h和4 h的B區(qū)分含量比較接近，在2 h時反而有所上升?？赡茉诿附膺^程中，Alcalase堿性蛋白酶首先將大豆蛋白切斷成為相對分子質量在12 000～30 000 Da的B區(qū)分的多肽，然后又將B區(qū)分的多肽酶解成相對分子質量更小的C區(qū)分的多肽、小肽，在單位時間段，前者酶解生成的B區(qū)分的數(shù)量以及C區(qū)分的多肽、小肽可能復合形成的B區(qū)分的數(shù)量之和，大于后者B區(qū)分酶解的數(shù)量，從而出現(xiàn)B區(qū)分反而有所增多的現(xiàn)象。

由圖3可見：隨著酶量增加與酶解時間的延長，大分子蛋白質不斷減少；當酶量為1 000 U/g時，酶解0.5 h的酶解液樣品，其相對分子質量基本在25 000 Da以下，相較于麥汁的一般Lundin分布來說，A區(qū)分含量較少。因此，考慮啤酒的營養(yǎng)要求與酶解效果，選取酶量為750 U/g。

2.2 pH對大豆蛋白酶解產(chǎn)物的影響

Alcalase堿性蛋白酶的最適pH為8.0。本實驗底物質量分數(shù)5%，酶解溫度55℃，酶量750 U/g，分別在pH為7.0、8.0和9.0下進行酶解，過程滴加0.5 mol/L NaOH保持pH不變。取不同時間段的酶解液測量其蛋白質回收率和水解度、酶解液Lundin分布以及電泳后的相對分子質量分布，結果見圖4～圖6。

圖6 不同pH條件下隨反應時間變化所得酶解液的SDS-PAGE圖譜

圖4 pH對蛋白質回收率和水解度的影響

由圖4可見，隨pH增加和反應時間的延長，蛋白質回收率先增大后趨于平穩(wěn)。Alcalase屬于堿性蛋白酶，在堿性環(huán)境酶解效果較好，pH為8.0和9.0時，蛋白質回收率相差不大。當pH增大，逐漸接近Alcalase的最適反應pH時，其水解度呈明顯的上升趨勢，但當pH超過8.0時，水解度的變化并不大?？紤]到堿性較高會引起酶解液苦味加重，且可能產(chǎn)生不愉快的堿味，影響后續(xù)發(fā)酵液的感官品質，因此選擇pH 8.0的酶解條件較為適宜。

由圖5可見，在pH 7.0～9.0下，隨著反應時間的延長，C區(qū)分的含量都最大，占比超過60%，且變化較小。另外，pH對于Lundin分布的影響小于酶量的影響。Alcalase屬于堿性蛋白酶，在中性條件下酶解效果較弱，pH 7.0時高分子蛋白含量比較多，A區(qū)分含量較高。

對于在pH 9.0下1～4 h階段的酶解，B區(qū)分分布相近；反應4.0～6.0 h，此階段大分子的蛋白質絕大多數(shù)已經(jīng)不再被酶解了，繼續(xù)生成B區(qū)分的數(shù)量有限，由此導致B區(qū)分的增加變??；而B區(qū)分還有相當數(shù)量又繼續(xù)被酶解成C區(qū)分，由此導致B區(qū)分含量降低?？梢?，可以利用酶解pH的變化控制大豆酶解液中高分子蛋白的含量。

由圖6可見，隨著pH增大，反應所得酶解液的相對分子質量逐漸降低，但是降低的趨勢較為緩慢。當pH增大到9.0時，反應2 h仍有少量20 100 Da左右的多肽存在，pH對蛋白質回收率的影響小于酶量對蛋白質回收率的影響，考慮到水解度以及對后續(xù)發(fā)酵液的影響，選取pH為8.0。

2.3 酶解溫度對大豆蛋白酶解產(chǎn)物的影響

底物質量分數(shù)5%，pH 8.0，酶量750 U/g，分別在50、55、60、65℃下進行酶解，過程滴加0.5 mol/L的NaOH溶液保持pH 8.0。取不同時間段的酶解液測定其蛋白質回收率和水解度、酶解液Lundin分布以及電泳后的相對分子質量分布，結果見圖7～圖9。

圖9 不同酶解溫度條件下隨反應時間變化所得酶解液的SDS-PAGE圖譜

圖7 酶解溫度對蛋白質回收率和水解度的影響

由圖7可見，在50～65℃的酶解溫度范圍，蛋白質回收率先隨溫度上升而增大，55℃有較大或最大的蛋白質回收率，然后開始降低。可能高溫加速了小分子肽的聚合作用，重新生成了相對分子質量較大的蛋白，使可溶性蛋白的含量降低。在50～65℃的溫度范圍，蛋白質回收率隨反應的進行而增大，3.0 h時具有最大值，然后開始下降；65℃下蛋白質回收率的變化較大，反應4.0 h之后，蛋白質回收率降低幅度大。

從圖8可見，酶解溫度對Lundin分布的影響較為顯著。當酶解溫度高于55℃，使酶活力有所降低，導致A、B區(qū)分的含量產(chǎn)生明顯變化。當酶解溫度為65℃時，A區(qū)分含量相對較高，與圖7 65℃的變化曲線一致。

圖8 酶解溫度對酶解液Lundin A、B和C區(qū)分分布的影響

結合圖8、圖9可見，在60、65℃酶解2 h階段，A、B區(qū)分的含量較高，但C區(qū)分產(chǎn)生量不多，聚集作用可能又使之減少，65℃時總含量小于60%，作為啤酒發(fā)酵液，將導致酵母細胞生長所需的α-氨基氮的含量過低，酵母生長不良，影響酒液的品質。另外，在工廠條件下，一般溫度控制在45～55℃之間。綜上所述，考慮到蛋白質回收率、水解度和A、B和C區(qū)分的相對分子質量分布關系，選擇酶解溫度為55℃。

2.4 底物質量分數(shù)對大豆蛋白酶解產(chǎn)物的影響

酶量750 U/g，pH 8.0，酶解溫度55℃，底物質量分數(shù)分別為4%、5%、6%和7%下進行酶解，滴加0.5 mol/L的NaOH溶液保持pH在8.0。取不同時間段的酶解液測定其蛋白質回收率、水解度(2.5 h)以及電泳后的相對分子質量分布，結果見圖10和圖11。

圖11 不同底物質量分數(shù)條件下隨反應時間變化所得酶解液的SDS-PAGE圖譜

高底物濃度具有較高的酶解效率，對提高生產(chǎn)設備利用率有好處。但過高的底物濃度又造成酶解液黏度增大，影響蛋白酶的擴散，降低水分活度，對酶解反應有一定的抑制作用。由圖10可見，從蛋白質回收率來看，底物質量分數(shù)越高，蛋白質回收率越低。因此，考慮到生產(chǎn)實際情況及蛋白質回收率，選擇適中的底物質量分數(shù)是必要的。

圖10 底物質量分數(shù)對蛋白質回收率和水解度的影響

由圖11可見，低底物質量分數(shù)條件下反應在初始酶解階段，所得的多肽分布情況大致相似，當?shù)孜镔|量分數(shù)提高以后，相對分子質量高的肽類增加較多，酶解物的溶解性會變差，使發(fā)酵所得的啤酒的生物穩(wěn)定性降低。綜上，選擇酶解大豆蛋白的底物質量分數(shù)為5%，反應時間為0.5～1.0 h。此時大豆蛋白酶解液為淺棕色，苦味稍重。

3 結 論

(1)通過單因素實驗得知，Alcalase蛋白酶對大豆蛋白有很好的酶解作用。Alcalase蛋白酶酶解大豆蛋白制取復配酶解液的最佳條件為：酶解溫度55℃，底物質量分數(shù)5%，酶量750 U/g，pH 8.0，反應時間0.5～1.0 h。在最佳條件下所得的酶解液為淺棕色，苦味稍重，蛋白質回收率約65%，所得到的酶解液的Lundin分布比較接近麥汁Lundin區(qū)分分布的要求。采用Alcalase蛋白酶制取啤酒糖漿的含氮復配液是可行的。

(2)復配糖漿可提高啤酒用糖漿有機含氮營養(yǎng)元素含量，在啤酒釀造中將具有更好的效果，具有積極的現(xiàn)實意義。