瘦素對雄激素性脫發(fā)小鼠模型毛囊的影響

溫旭紅 張高峰 潘 倫 劉官智

四川省自貢市第四人民醫(yī)院皮膚科，自貢，643000

雄激素性脫發(fā)(androgenetic alopecia，AGA)是一種好發(fā)于中青年男性的最常見的脫發(fā)性疾病，發(fā)病率高，對患者心理、社交產(chǎn)生嚴重的影響。目前AGA治療主要方法包括：(1)外用米諾地爾，通過開放細胞膜上K離子通道，產(chǎn)生血管舒張效應；(2)口服非那雄胺，阻斷睪酮轉(zhuǎn)變?yōu)槎洳G酮從而減弱雄激素對毛囊的抑制作用；(3)口服西咪替丁、安體舒通等雄激素受體競爭劑；(4)自體毛發(fā)移植。藥物常有不同程度的不良反應如局部接觸性皮炎、多毛癥、性功能障礙、心肌梗塞和厭食等，并且不能阻斷病程，也無法誘導毛囊的再生，治療時間長，停藥后常復發(fā)。而毛囊移植操作創(chuàng)傷大、毛囊存活率有限。因此尋找一種安全性高、可以促進毛囊再生的方法一直是雄激素性脫發(fā)的研究熱點。

目前Yang等[1]研究發(fā)現(xiàn)在男性雄激素性脫發(fā)中，體重指數(shù)較高的人可能會有更嚴重的脫發(fā)，尤其是發(fā)病年齡較早的患者。并且AGA 受試者中血漿瘦素水平顯著高于非-AGA的受試者，且瘦素水平與嚴重程度成正相關[2]，但目前基礎研究中瘦素更多的被認為是一種毛囊生長期的誘導劑[3]。例如研究發(fā)現(xiàn)瘦素在毛乳頭細胞的退行期、靜止期和生長期早期均有表達[4]。研究發(fā)現(xiàn)，5周大的C57/BL6老鼠被毛毛囊已經(jīng)處于第一個生長期的后期，但瘦素受體缺乏的db/db轉(zhuǎn)基因老鼠毛囊仍在第一個靜止期，而在7周大野生型老鼠剃毛的背部皮膚中注射瘦素20天后，注射區(qū)毛發(fā)生長，而db/db轉(zhuǎn)基因老鼠局部注射瘦素未見毛發(fā)生長[5]。瘦素水平在毛囊生長期初期最低，在生長期后期逐漸升高，靜止期階段中最高，也表明瘦素可能是毛囊進入生長期誘導劑[6]。糖皮質(zhì)激素及卵巢性激素均可刺激瘦素分泌,而雄激素則抑制其分泌[7]，同時有研究報道缺乏雄激素性受體老鼠會變得肥胖[8]。因此我們猜測AGA 患者由于局部雄激素增高、雄激素受體功能增強可能降低局部脂肪細胞中瘦素的表達，抑制了JAK2-STAT信號通路的活性，從而影響毛囊細胞的生長周期及遷移等，最終導致 AGA患者出現(xiàn)脫發(fā)?；诖宋覀冊噲D通過外源性補充瘦素以達到治療雄激素性脫發(fā)的目的。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器

1.1.1 實驗動物 40只C57雄性小鼠，體重 20～22 g，12周左右，購于成都達碩實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證：SCXK(川)2015-030，動物使用許可證：SCXK (川)2019-189。

1.1.2 主要實驗試劑 丙酸睪酮注射液(1 mL：25 mg，10支/盒，杭州動物藥品廠)、5%米諾地爾酊(蔓迪，90 mL，浙江萬晟藥物有限公司)、重組小鼠瘦素蛋白(CF，498-OB-05M，R&D system)、anti-GAPDH(abcam，EPR 16891)、anti-AR(abcam，AB 198394)、anti-Ki 67(abcam，ab 92742)、羊抗兔IgG(博奧森生物，bs-0295G-HRP)、羊抗鼠IgG(博奧森生物，bs-0296G-HRP)、全蛋白提取試劑盒(凱基生物，KGP 2100)、ECL化學發(fā)光液(博奧森，C 05-07004)、廣譜SP免疫組化檢測試劑盒(博奧森生物，SP-0022)、HE Staining Kit(博奧森生物，C 02-04004)、tunnel試劑盒(凱基生物,KGA7071)。

1.1.3 實驗儀器 熒光顯微鏡(IX81，日本奧林巴斯)、Image-Pro Plus(Media Cybernetics, Silver Spring, MD，USA)、凝膠成像系統(tǒng)(UVP，EC 3300，美國)。

1.2 實驗動物分組及處理 實驗將40只12周雄性C57小鼠按體重編號后隨機分組，空白組10只、模型組10只、米諾地爾組10只、瘦素組10只，飼養(yǎng)于溫度(23±2)℃，濕度(54±10)%環(huán)境，自由飲食、飲水。除空白組外，均選小鼠背部給與藥物皮下注射，均予以注射丙酸睪酮5 mg/kg·d，4周建模成功后，模型組僅繼續(xù)注射丙酸睪酮5 mg/kg·d，米諾地爾組予以注射丙酸睪酮5 mg/kg·d+外用5%米諾地爾酊0.2 mL/d，瘦素組予以注射丙酸睪酮5 mg/kg·d+重組小鼠瘦素20 μg，每日1次，再連續(xù)4周。

1.3 標本獲取與處理

1.3.1 8周后肉眼觀察毛發(fā)生長情況并行照相存檔。HE染色進行毛囊形態(tài)調(diào)查：實驗第8周結(jié)束時，留取各組小鼠背部脫發(fā)區(qū)皮膚約1 cm×1 cm后行組織HE染色，觀察小鼠毛囊形態(tài)學變化，100倍顯微鏡視野下，平均3個不重疊視野，1 mm皮膚長度范圍內(nèi)利用Image-Pro Plus(Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA)測量毛囊長度及大小，統(tǒng)計生長期毛囊數(shù)量與休止期毛囊數(shù)量比值(A/T)。

1.3.2 Ki 67增殖及tunnel凋亡檢測 (1)Ki 67免疫組化染色觀察毛囊細胞增殖情況：毛囊切片1%甲醛固定，常規(guī)脫水，包埋，切片，脫蠟復水，抗原修復，然后與兔抗小鼠Ki 67抗體(anti-Ki 67,ab 92742,abcam,USA)孵育，DAB顯色。(2)tunnel熒光染色觀察毛囊細胞中凋亡細胞碎片：通過抗地高辛配基異硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗兔抗體顯示，用DAPI細胞核染色。Ki 67和tunnel的陰性對照組分別為省略兔抗小鼠Ki 67抗體或TdT-酶。每只隨機選取免疫組化切片，陽性染色區(qū)，5個不重復視野，分別對毛囊上皮中陽性細胞進行觀察，圖像分析Image-Pro Plus(Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA)分析積分光密度值，統(tǒng)計學分析。

1.3.3 局部AR受體Western blot檢測 選取各組小鼠背部脫發(fā)皮膚，生理鹽水迅速沖洗，放入液氮中保存，采用凱基蛋白提取試劑盒提取全蛋白，采用BCA法進行蛋白定量，室溫封閉120 min，一抗：兔抗鼠AR、兔抗鼠GAPDH室溫孵育30 min后4 ℃過夜，二抗羊抗兔1∶4 000室溫孵育1 h，暗室曝光，凝膠成像系統(tǒng)(UVP，EC3300，美國)采集圖像并計算各組灰度值。

2 結(jié)果

2.1 肉眼觀察脫發(fā)情況 8周后模型組較空白組相比脫發(fā)面積明顯增加，米諾地爾組及瘦素組與模型組相比脫發(fā)面積均明顯縮小，各組用藥區(qū)無紅腫、糜爛、滲出、潰瘍等情況，見圖1。

2.2 HE觀察各組生長期/休止期毛囊數(shù)比例 8周后模型組較空白組生長期/休止期毛囊數(shù)比值明顯降低(P<0.05)，米諾地爾組與瘦素組較模型組生長期/休止期毛囊數(shù)比值明顯增加(P<0.05)，且米諾地爾組與瘦素組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見圖2、表1。

2.3 瘦素對毛囊細胞增殖作用的影響 模型組、米諾地爾組及瘦素組Ki 67表達均較空白組低(P<0.05),米諾地爾組及瘦素組較模型組相比Ki 67表達增高(P<0.05)，瘦素組與米諾地爾組相比Ki 67表達降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3、表2。

表1 各組A/T值

2.4 瘦素對毛囊細胞凋亡情況的影響 Tunnel結(jié)果顯示模型組凋亡細胞數(shù)量較空白組明顯增加(P<0.05)，米諾地爾組較空白組相比凋亡細胞數(shù)量無明顯差別(P>0.05)，但較模型組相比凋亡表達減少(P<0.05)，瘦素組較空白組凋亡表達無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，但較模型組凋亡表達同樣明顯降低(P<0.05)，且米諾地爾組與瘦素組相比無明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05)，見圖4、表3。

1a:空白組;1b:模型組;1c:米諾地爾組;1d:瘦素組

2a：空白組以終毛為主；2b：模型組多見毛干直徑小、毛干色淺的休止期毛囊；2c、2d：米諾地爾組及瘦素組可見較多毛干顏色加深、毛干直徑大的生長期毛囊

圖3 8周后各組小鼠脫發(fā)區(qū)Ki 67表達情況：模型組(3b)毛囊細胞Ki 67表達較空白組(3a)明顯降低，米諾地爾組(3c)及瘦素組(3d)Ki 67均為高表達(免疫組化，×100)

4a：空白組；4b：模型組；4c：米諾地爾組；4d：瘦素組

表2 各組Ki67表達情況

表3 各組凋亡表達結(jié)果

2.5 瘦素對雄激素性受體的影響 模型組、米諾地爾組及瘦素組較空白組相比AR受體表達升高(P<0.05)，但米諾地爾組與模型組相比及瘦素組與模型組相比，均無統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，見圖5、表4。

圖5 各組AR受體WB結(jié)果(A為空白組、B為模型組、C為米諾地爾組、D為瘦素組)

表4 各組雄激素受體表達結(jié)果

3 討論

瘦素(leptin)是一種16KD蛋白質(zhì)，它是一種激素或細胞因子，主要由脂肪細胞分泌，由肥胖基因(ob)編碼。在下丘腦中，瘦素與受體結(jié)合后發(fā)揮其主要效應-抑制攝食行為，促進代謝，調(diào)節(jié)全身能量平衡。因此目前將瘦素用于治療全身脂肪代謝障礙的1型糖尿病患者的有效性已有報道[9]。隨著脂肪生物學研究深入，人們發(fā)現(xiàn)皮膚和毛囊也可分泌瘦素，同時瘦素也可以通過多種途徑參與皮膚的生理病理過程，雖然瘦素對皮膚相關性疾病的治療作用目前仍處于空白，但關于瘦素及受體與皮膚及相關疾病的關系逐漸被報道。例如Cerman[10]及黃朝衛(wèi)等[11]研究證實重度銀屑病患者血清瘦素、組織中瘦素、瘦素受體表達明顯高于輕度、中度銀屑病患者及對照組。畢桂姣[12]發(fā)現(xiàn)天皰瘡患者血清瘦素水平增高、可溶性瘦素受體水平降低；曹瑛[13]研究糖尿病慢性潰瘍中皮膚組織 Leptin mRNA及OB-RL mRNA的基因表達水平均較正常皮膚組織減少可能是其愈合延遲原因之一。而在創(chuàng)傷中l(wèi)eptin和受體通過活化JAK/STAT通路等促進角化細胞增殖，因此可以參與創(chuàng)傷愈合[14]。在免疫方面，瘦素受體均可在T細胞和B細胞上表達，瘦素可刺激T細胞增生和Th1反應,抑制T細胞凋亡，并可誘導單核巨噬細胞分泌炎癥細胞因子等參與免疫作用，因此在SLE、白塞病、銀屑病等均參與發(fā)生發(fā)展[15]。因此瘦素不僅僅是一種能量調(diào)節(jié)因子，也可以通過自分泌或者旁分泌方式通過促進血管生成、調(diào)節(jié)炎癥和免疫等影響皮膚衰老、創(chuàng)面愈合及毛囊的生長。

毛囊作為皮膚重要附屬器官，具有周期性生長的特點：生長期、退行期、休止期，這種周期性的循環(huán)是由表皮細胞與真皮間充質(zhì)細胞相互作用的結(jié)果，近年來研究發(fā)現(xiàn)脂肪細胞與毛囊細胞間通過生長信號相互交流，促進了毛發(fā)周期循環(huán)[6]。真皮脂肪層厚度變化與毛囊的自然再生發(fā)生了同步變化：在毛囊生長階段，皮內(nèi)脂肪細胞層擴張，而靜止期脂肪層則變薄[16]。并且患有Goltz綜合征或局部真皮發(fā)育不全的患者，皮膚脂肪組織發(fā)生變化，同時伴有稀疏的、脆弱的頭發(fā)及局部脫發(fā)[17，18]。而缺乏皮膚脂肪組織或脂肪細胞功能障礙的小鼠表現(xiàn)出皮膚及毛發(fā)生長的缺陷[19，20]。在治療方面，F(xiàn)ukuoka等[21]用培養(yǎng)脂肪干細胞(ADSCs)的培養(yǎng)基用于治療脫發(fā)，可明顯誘導頭發(fā)生長。此外，在萎縮性瘢痕性脫發(fā)患者中，自體脂肪移植能夠誘導眉毛再生，并在線形凹陷性萎縮性瘢痕和禿斑上取得顯著的臨床改善[22]。而David等[23]通過提取自體腹部脂肪，獲取富含脂肪基質(zhì)血管成分的細胞懸液后注射于雄激素性脫發(fā)患者頭皮脫發(fā)區(qū)，可以明顯促進毛發(fā)生長。這些脂肪細胞對毛囊的影響一部分可能與前體脂肪細胞分化增殖相關，另一方面可能由于脂肪細胞分泌脂肪因子通過自分泌或旁分泌方式調(diào)節(jié)毛囊生長發(fā)育[15]。其中最重要的兩種脂肪因子為瘦素和脂聯(lián)素(adiponectin)。己有研究證實了瘦素和瘦素受體在人體及小鼠皮膚角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞[24]、毛乳頭細胞[4]、毛母質(zhì)、內(nèi)根鞘[25]等處均有表達，有學者研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素可以通過促進毛發(fā)角質(zhì)形成細胞增殖促進體外培養(yǎng)的毛囊的毛干生長，經(jīng)脂聯(lián)素處理的體外培養(yǎng)的毛乳頭細胞胰島素樣生長因子(IGF)-1、肝細胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)mRNA表達明顯增加[26]。但瘦素對脫發(fā)性疾病的治療作用研究報道仍較少。

本研究顯示，局部注射瘦素可明顯促進雄激素性脫發(fā)小鼠毛發(fā)生長，脫發(fā)面積明顯減小，其治療效果與外用米諾地爾相當，而HE染色提示瘦素組生長期毛囊/退行期毛囊比例明顯增加，表明瘦素可誘導毛囊提前進入生長期或延長生長期。我們認為以上治療效果可能與以下機制相關：(1)瘦素可通過激活JAK2-STAT3信號通路影響線粒體功能，増強線粒體活性，促進細胞代謝，改善及恢復皮膚的修復再生功能，誘導血管生成，促進創(chuàng)面愈合和毛發(fā)生長循環(huán)[27，28]，我們實驗中通過增殖及凋亡檢測也表明瘦素和米諾地爾均可抑制凋亡，促進細胞增殖代謝；(2)在小鼠被皮中，瘦素受體在隆突部位上皮(K15陽性)處表達，且在靜止期及生長期均有表達[6]，隆突部位為毛囊干細胞所在位置，瘦素可能與局部受體結(jié)合后通過影響毛囊干細胞分化、增殖或遷移，從而激活毛囊再生長；(3)研究證實雄性激素受體(AR)表達增強的老鼠可通過阻止前脂肪細胞的分化[29]以及促進脂質(zhì)合成[30]降低脂肪體積大小和重量，而我們研究中表明局部注射瘦素并不能抑制局部雄激素受體表達，但其是否與濃度相關還需要進一步探索；(4)瘦素誘導人角質(zhì)形成細胞的STAT3信號通路通過影響角質(zhì)形成細胞的分化、增殖、遷移等間接影響毛囊生長[31]；另外也可通過調(diào)節(jié)其他細胞因子及激素水平等影響毛囊生長分化。這些機制與既往治療雄激素性脫發(fā)機制有明顯不同。

綜上我們認為瘦素可治療雄激素性脫發(fā)，且治療效果及藥物發(fā)揮作用與外用米諾地爾相當，且瘦素是一種人體自身分泌的多效能因子，對機體更安全有效，我們在背部局部注射瘦素過程中，小鼠背部皮膚無不良表現(xiàn)，小鼠未表現(xiàn)出消瘦、進食減弱、活動減少等情況，表明局部注射瘦素不足以影響小鼠全身激素代謝水平，而瘦素作用機制也許與誘導毛囊再生有明確相關性，這也許在維持雄激素性脫發(fā)治療效果上能獲得更為持久效果，因此調(diào)節(jié)自體瘦素分泌或外源性補充瘦素可能成為一種治療雄激素性脫發(fā)的新的安全、簡單、有效的方法。