Fez家族鋅指蛋白 1反義RNA 1在宮頸癌組織中表達(dá)及與患者臨床特征及預(yù)后的相關(guān)性

黃麗，龔豪，張春蓮，方彩云，黃潤強(qiáng)

十堰市太和醫(yī)院1婦科，2腎病內(nèi)科，湖北 十堰442000

宮頸癌是發(fā)病率居全球第2位的女性惡性腫瘤，是女性惡性腫瘤病死的主要原因[1-3]。宮頸癌臨床標(biāo)準(zhǔn)化治療方案包括放療、化療及根治性切除術(shù)，術(shù)后患者預(yù)后差異較大，目前仍缺乏有效評估其預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。隨著現(xiàn)代基因芯片技術(shù)與基因測序技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的非編碼RNA經(jīng)研證實(shí)在人體疾病診治中發(fā)揮著重要作用[4-5]。既往研究認(rèn)為，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是基因組RNA里面“轉(zhuǎn)錄噪聲”，亦被證實(shí)能夠于表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄與完成轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控相應(yīng)基因表達(dá)。研究表明，F(xiàn)ez家族鋅指蛋白 1反義 RNA1（FEZF1 antisense RNA 1，F(xiàn)EZF1-AS1）在惡性腫瘤病灶發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[6]。本研究擬探討FEZF1-AS1在宮頸癌組織中的表達(dá)情況及其與患者臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月至2016年7月十堰市太和醫(yī)院收治的宮頸癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①有手術(shù)適應(yīng)癥，且經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為宮頸癌；②術(shù)前未接受放療、化療及其他抗腫瘤治療；③臨床資料及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①國際婦產(chǎn)科協(xié)會（Federation Intemational of Gynecologie and Obstetrigue，F(xiàn)I-GO）分期Ⅱ～Ⅳ期；②合并代謝異常性疾?。虎酆喜⒅匾鞴偈軗p，如肺肝膽腎等；④合并急性心腦血管相關(guān)疾??；⑤合并其他惡性腫瘤；⑥合并嚴(yán)重精神疾病。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入100例宮頸癌患者，年齡31～68歲，平均（57.67±6.48）歲。取100例宮頸癌患者的宮頸癌組織及相應(yīng)的癌旁正常組織（與腫瘤組織距離＞5 cm），均于手術(shù)切除后10 min內(nèi)完成獲取操作，-80℃保存?zhèn)錂z。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要試劑和儀器熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒、RNA提取試劑盒和RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自諾維贊生物公司，Biotek Epoch微量核酸定量儀購自美國Biotek公司，7500型熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2.2 實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測FEZF 1-AS 1mRNA相對表達(dá)量依據(jù)RNA提取試劑盒說明書提取腫瘤組織和相應(yīng)癌旁正常組織的總RNA，以定量分光光度法檢測 D（260）/D（280），對 RNA 進(jìn)行定量。嚴(yán)格依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中的說明書完成反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。按照實(shí)時熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系20μl，主要包括正向引物2μl、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μl、反向引物2 μl、純水4 μl和2×實(shí)時熒光定量PCR Mix試劑10μl。反應(yīng)條件：95℃30 s，95℃5 s，60℃30 s，共8個循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參，以2-△△Ct計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。FEZF1-AS1正向引物：5'-TTAGGAGGCTTGTTCTGTGT-3'，反向引物 ：5'-GCGCAGGTACTTAAGAAAGA-3'；GAPDH正向引物：5'-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3'，反向引物：5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'。

1.2.3 原位雜交染色法檢測FEZF 1-AS 1的表達(dá)情況采取原位雜交寡核苷酸探針進(jìn)行寡核苷酸探設(shè)計(jì)。首先將組織切片放在60℃烤箱里面烤片2 h，通過60℃二甲苯進(jìn)行3次脫蠟處理，每次5 min；以梯度乙醇（分別為99.9%、96%、70%）水化，每次5 min；磷酸鹽緩沖液洗5 min；焦碳酸二乙酯水洗5 min。對內(nèi)源性過氧化物酶進(jìn)行滅活處理，暴露mRNA核酸片段；然后進(jìn)行預(yù)雜交及雜交操作，滴加二抗及過氧化物酶，予以顯色處理。結(jié)果判定：FEZF1-AS1蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，棕黃色染色為細(xì)胞陽性，按照染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評分，染色強(qiáng)度：未著色計(jì)為0分，黃色染色計(jì)為1分，淺黃色染色計(jì)為2分，棕黃色染色計(jì)為3分；陽性細(xì)胞所占比例：陽性細(xì)胞所占比例＜10%計(jì)為1分，陽性細(xì)胞所占比例為11%～50%計(jì)為2分，陽性細(xì)胞所占比例為51%～70%計(jì)為3分，陽性細(xì)胞所占比例＞70%計(jì)為4分。將染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占比例相乘，0分為陰性，1～4分為弱陽性，5～8分為中度陽性，＞8分為強(qiáng)陽性。

1.3 隨訪方法

患者出院后，采取電話方式，對其進(jìn)行為期3年的隨訪，期間以發(fā)生終點(diǎn)事件（死亡）為截止時間，詳細(xì)記錄患者生存情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存率的比較采用Log-rank檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FEZF 1-AS 1 mRNA相對表達(dá)量的比較

宮頸癌組織中FEZF1-AS1mRNA的相對表達(dá)量為（6.15±0.74），明顯高于癌旁正常組織的（4.02±0.53），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=23.401，P=0.000）。

2.2 FEZF 1-AS 1陽性表達(dá)率的比較

宮頸癌組織中FEZF1-AS1陽性表達(dá)率為38.00%（38/100），明顯高于癌旁正常組織的8.00%（8/100），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=25.409，P=0.000）。

2.3 不同臨床特征宮頸癌患者宮頸癌組織中FEZF 1-AS 1相對表達(dá)量的比較

不同年齡、腫瘤直徑、人乳頭瘤病毒感染（human papilloma virus，HPV）情況和病理類型宮頸癌患者宮頸癌組織中FEZF1-AS1mRNA相對表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者宮頸癌組織中FEZF1-AS1mRNA的相對表達(dá)量均明顯高于中高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 不同臨床特征宮頸癌患者宮頸癌組織中FEZF 1-AS 1mRNA相對表達(dá)量的比較

2.4 FEZF 1-AS 1的表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性

Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，F(xiàn)EZF1-AS1的表達(dá)與分化程度與呈負(fù)相關(guān)（r=-0.369，P＜0.05），與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（r=0.718，P＜0.05）。

2.5 FEZF 1-AS 1表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

隨訪3年，宮頸癌患者宮頸癌組織FEZF1-AS1陽性表達(dá)患者生存26例，3年總生存率68.42%（26/38），低于FEZF1-AS1陰性表達(dá)患者的90.32%（56/62），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.910，P＜0.05）。（圖1）

圖1 FEZF 1-AS 1陽性表達(dá)（ n=38）與FEZF 1-AS 1陰性表達(dá)（ n=62）宮頸癌患者的生存曲線

3 討論

大量流行病學(xué)及分子生物學(xué)研究指出，高危型人乳頭瘤病毒（high risk-human papilloma virus，HRHPV）持續(xù)感染是宮頸癌與其癌前病變出現(xiàn)的主要原因，但HR-HPV感染并不是引起宮頸癌疾病唯一因素，人體基因改變更是該疾病發(fā)生發(fā)展重要影響因素[7-8]。LncRNA主要為轉(zhuǎn)錄本長度在200 nt以上的一類RNA分子，并不編碼蛋白，通常以RNA形式于各類層面上（包括表觀遺傳調(diào)控層面、轉(zhuǎn)錄調(diào)控層面與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控層面等）調(diào)控人體基因表達(dá)水平?；虮磉_(dá)的調(diào)控過程較復(fù)雜，一般需多個或共同因子一起參與進(jìn)行，既往醫(yī)學(xué)認(rèn)為，LncRNA并不能發(fā)揮生物學(xué)功能，但近年來越來越多研究證實(shí)，LncRNA參與了人體X染色體沉默、染色質(zhì)修飾、基因組印記、轉(zhuǎn)錄激活、核內(nèi)運(yùn)輸及轉(zhuǎn)錄干擾等各類重要調(diào)控過程[9-10]。由于腫瘤細(xì)胞里面某些特定LncRNA呈異常表達(dá)，因此，特異型LncRNA表達(dá)水平能夠作為腫瘤診斷及療效評估的有效指標(biāo)[11-12]。

FEZF1-AS1作為一種臨床新發(fā)現(xiàn)LncRNA，在結(jié)直腸癌、胃癌、肝細(xì)胞癌等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在腫瘤基因診斷、臨床治療指導(dǎo)及預(yù)后評估等方面均存在較大的應(yīng)用前景[13-15]。Zhang和Li[16]通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者腫瘤組織與細(xì)胞內(nèi)FEZF1-AS1呈明顯高表達(dá)，并依據(jù)FEZF1-AS1表達(dá)水平差異分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，臨床病理分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)EZF1-AS1過表達(dá)與病理類型和腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)；對宮頸癌患者進(jìn)行平均24個月的隨訪發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)EZF1-AS1高表達(dá)患者整體生存率更低，術(shù)后生存時間更短；單因素分析顯示，F(xiàn)EZF1-AS1高表達(dá)、低分化和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均與較差的預(yù)后相關(guān)；多因素分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)EZF1-AS1是宮頸癌患者預(yù)后重要獨(dú)立預(yù)測因子。

本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織中FEZF1-AS1mRNA的相對表達(dá)量高于癌旁正常組織，表明宮頸癌組織中FEZF1-AS1的表達(dá)上調(diào)。本研究結(jié)果顯示，低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者宮頸癌組織中FEZF1-AS1mRNA的相對表達(dá)量均高于中高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者，表明組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況可能是宮頸癌組織FEZF1-AS1表達(dá)影響因素。相關(guān)性分析顯示，F(xiàn)EZF1-AS1的表達(dá)與分化程度與呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)EZF1-AS1的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，提示分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生情況與宮頸癌組織FEZF1-AS1的表達(dá)密切相關(guān)。Kaplan-Meier生存分析顯示，F(xiàn)EZF1-AS1陽性表達(dá)患者3年總生存率68.42%，低于FEZF1-AS1陰性表達(dá)患者的90.32%，表明FEZF1-AS1的表達(dá)與宮頸癌患者不良預(yù)后密切相關(guān)。但本研究納入樣本量較小，尚需進(jìn)一步進(jìn)行大樣本臨床研究進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，宮頸癌組織中FEZF1-AS1的表達(dá)上調(diào)，與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)，且可能與宮頸癌患者的預(yù)后有關(guān)。